超滤法浓缩富集牡蛎蛋白抗氧化活性肽

郝更新，曹文红，郝记明，章超桦，*

(1.中国科学院南海海研究所，广东广州510301;2.集美大学生物工程学院，福建厦门361021;3.中国科学院研究生院，北京100049;4.广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524025)

牡蛎是四大养殖贝类之一，目前我国已成为世界上牡蛎养殖大国，年产量已经达到了35.0万t，其中福建为14.5万t［1］。国内对牡蛎的利用仍然以鲜食和干制品为主，少量加工成蚝油或其它调味品，对其深加工的研究相对较少，附加值较低。牡蛎营养价值非常高，以干基计，蛋白质(39.1%～53.1%)，脂肪(7.8%～8.7%)，糖原(21.6%～38.9%)［2］。同时，牡蛎是我国卫生部批准的第一批药用兼保健的功能性食品，已有许多学者对其展开活性成分的提取和分析研究。然而水产动物蛋白作为主要的营养成分往往是没有生物活性的，需要在消化过程中产生活性，也可以作为前体蛋白水解制备生物活性肽［3］。利用蛋白酶制备生物活性肽就是其中之一。尽管可以通过酶解工艺的优化获得分子质量相对较为集中的组分，但是蛋白质分子质量的大小、组成、结构等方面的多样性和复杂性不可避免地将导致蛋白质酶解液的成分复杂多样。因此，寻找经济合理分离富集牡蛎蛋白酶解液中的小分子活性肽的方法就成为技术关键。超滤法由于可以按膜的截留相对分子质量(MWCO)对物料进行分离，用于蛋白质制品的纯化具有工艺流程短、耗用化学试剂少、操作简单、成本低、易于工业化生产等优点，具有较大的推广潜力［4］。本研究通过超滤工艺对牡蛎贝肉蛋白酶解液进行处理，分离富集抗氧化活性肽，同时为超滤技术分离纯化其它生物活性肽提供参考。

表1 超滤对清除自由基活性的影响Table 1 Scavenging activity of ultrafiltration against free radicals

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜牡蛎 厦门集美人人乐购物广场，塑料袋分装，－18℃保存;葡聚糖凝胶(Sephadex)G－25 Sigma公司。

UV－5200型紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;日立835－50型高速氨基酸分析仪 日本Hitachi公司;SCM杯式超滤系统 上海斯纳普膜分离科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 牡蛎酶解液的制备 新鲜牡蛎洗净，按料水比1∶3(mg∶mL)加入预冷的蒸馏水，高速匀浆后加入中性蛋白酶，加酶量为1500U/g底物，于43.7℃恒温水浴酶解 225min，酶解结束后 100℃水浴灭酶15min，冷却，再以 4000r/min，离心 10min，取上清液分装，即得牡蛎酶解液，冷藏备用。

1.2.2 牡蛎酶解液的膜分离 使用截留分子量为10000u的聚醚砜超滤膜对牡蛎酶解液进行超滤处理，将可溶性物质分为 ＞10000u和 ＜10000u两部分;再使用截留分子量为4000u的聚醚砜超滤膜对＜10000u的超滤液进行超滤处理，又可分成4000～10000u和＜4000u两部分。超滤后的各组分的可溶性蛋白浓度采用Folin－酚法测定。

1.2.3 数据测定 分别测定羟自由基清除率［5］、DPPH 自由基清除率［6］、超氧阴离子清除率［7］、抑制肝脂质过氧化实验［8］、还原力［9］，并对氨基酸组成进行测定［10］。

1.2.4 超滤液分子量分析 超滤液分子质量的测定采用葡聚糖凝胶柱层析法。采用牛血清白蛋白(MW67000u)、抑 肽 酶 (MW6500u)、杆 菌 肽(MW1450u)和L－酪氨酸(MW181u)作为标准物质。凝胶层析条件:凝胶类型:葡聚糖凝胶(Sephadex)G－25;凝胶柱的规格:16mm(内径)×90cm(长);洗脱液:双重蒸馏水;收集方法:SBS－100－LCD型自动部分收集器;检测波长:280nm。

4种标准物质的混合物经分离后，以各管在280nm的吸光值为纵坐标，以洗脱液收集管数为横坐标，得到标准肽洗脱体积。再根据标准肽洗脱流速求出各标准肽的洗脱体积(Ve)，然后制作标准肽的相对分子量的对数(x)与洗脱体积(y)关系的标准曲线:y=－38.653x+255.77，R2=0.956。

2 结果与讨论

2.1 不同组分对各种自由基的清除效果

羟自由基是体内最具活性的自由基，主要来源于超氧自由基，过氧化氢，脂质、蛋白和核酸等生物大分子的氧化［11］。DPPH·是一种稳定的自由基，即使在室温下也很稳定，它可以接受一个电子或是一个氢根离子变成一个稳定的分子［12］。超氧阴离子是体内最常见的自由基，它是氧分子通过接受一个电子后的复位形式。虽然超氧阴离子活性不高，但是它能通过歧化和其他反应产生过氧化氢和氢自由基，是体内自由基的来源，它可以杀死细胞，使酶失活，降解DNA、细胞膜和多糖［13］。生物细胞膜上的脂质过氧化被认为是需氧生物遇到氧化应激时细胞受损的主要机制之一。自由基攻击肝脂质膜中不饱和脂肪酸的双键，造成脂质过氧化，导致细胞器和细胞膜结构改变并引发功能障碍。同时，它也为体内进一步的过氧化反应连续不断地提供自由基［14］。在本研究中将上述自由基作为研究抗氧化活性的指标，由表1可知，＜10000u的2个超滤液组分与原液相比清除这些自由基的能力均有所提高;其中，＜4000u超滤液对这些自由基的清除效果最好，且与原液和＞10000u的组分均存在着显著性差异(p＜0.05)。

还原力是衡量抗氧化剂供电子能力的指标。由图1可知，原液和各超滤组分的还原力都是随着浓度的增加而增加，且相同的浓度下的＜4000u超滤液的还原力最高，其次是4000～10000u超滤液、原液和＞10000u超滤液。

图1 超滤对还原力的影响Fig.1 The effect of ultrafiltration on reducing power

表2 氨基酸组成(mmol/mL)Table 2 Amino acid composition(mmol/mL)

表3 超滤液中各组分的分子量分布及羟自由基清除活性Table 3 Distribution of MW and Hydroxyl radical scavenging activity of ultrafiltrate

类似地，刘成梅等［15］对罗非鱼鱼皮蛋白酶解液进行超滤处理，0.80mg/mL超滤液和0.03mg/mL抗坏血酸清除H2O2的能力相当;李琳等［16］采用连续串联超滤技术对鳙鱼蛋白酶解物进行分离，56.7%的肽段留在此滤过液中，且滤过物的抗氧化活性强于原酶解液;Zhou等［17］利用超滤膜截流玉米蛋白的中性蛋白酶酶解液得到的4个组分中以分子量为1～3ku的组分抑制脂质过氧化的活性最强。诸多实验证实，超滤处理对大多数具有较强活性的肽段有浓缩作用。

2.2 氨基酸分析

抗氧化肽的活性与氨基酸组成、结构和疏水性密切相关［18］。酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸等氨基酸可引起抗氧化活性［19］。芳香族氨基酸可以为失电子的自由基提供电子［20］。含有组氨酸的肽，其抗氧化活性与提供氢离子、吸附脂质过氧化氢自由基和咪唑基的螯合能力有关［21］。半胱氨酸的巯基由于可以直接与自由基作用因而具有抗氧化活性［22］。一般，富含组氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸的肽链可能具有较高的抗氧化活性［3］。根据表2数据计算上述7种氨基酸在各自样品中的含量，在原液和＜4000u的超滤液中分别为18.1%和21.2%，说明这些氨基酸经过超滤处理有了一定的富集。前面的抗氧化实验结果表明经过超滤处理抗氧化活性的提高，具有活性的物质得到了浓缩，这可能与这些氨基酸含量的升高有关。

2.3 凝胶层析

凝胶过滤层析是根据分离物质分子量大小不同而达到分离效果的一种色谱方法。将＜4000u超滤液上柱分离，在280nm处测定接收液吸光度，绘制洗脱曲线，见图2。由图2可以看出，层析图谱上有4个明显的洗脱峰。组分1洗脱峰出现在洗脱开始第46管左右的收集液中，组分2洗脱峰出现在洗脱开始第57管左右的收集液中，组分3洗脱峰出现在洗脱开始第68管左右的收集液中，组分4洗脱峰出现在洗脱开始第77管左右的收集液中，且各组分没有重叠，说明Sephadex G－25柱层析可将各组分分离。由于组分3和组分4无法测出可溶性蛋白，而且根据分子量标准曲线计算其分子量极低，可知它们为杂峰，因此不予以考察。分别合并39至50管，51管至62管。根据回归方程计算得各组分的分子量范围，测定可溶性蛋白浓度，检测羟自由基清除活性求IC50值，如表3所示。由表3可知，超滤液的组分1对羟自由基清除活性的IC50值为13.59mg/mL，占超滤液的39.59%，主要是一些小分子蛋白质和肽类。超滤液的组分2对羟自由基清除活性的 IC50值为20.82mg/mL，占超滤液的26.12%，主要是一些肽类和氨基酸。

图2 超滤液的Sephadex G－25凝胶过滤洗脱曲线Fig.2 Elution curve of enzymatic hydrolysate with gel filtration on Sephadex G－25

3 结论

牡蛎蛋白酶解液经超滤处理后，具有抗氧化能力的组分得到了浓缩。可能的原因是超滤后组氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸等对抗氧化肽活性影响较大的七种氨基酸的含量得到了富集。＜4000u的超滤液经Sephadex G－25分离及分子量分析，结果表明具有抗氧化活性的部分主要集中在550～3890u。经超滤处理后的牡蛎蛋白酶解液仍为混合物，建议下一步工作应分离并收集一系列单体化合物，以便专门研究结构与构效关系，对抗氧化能力较高的肽段氨基酸序列作进一步分析和研究。

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