真姬菇多糖分子结构特性及生物活性研究

包鸿慧，候凤蒙，刘志明，周 睿，曹龙奎，愈商权

(1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆163319;2.韩国江陵原州大学海洋生物科技学院，韩国，江源江陵210－702)

真姬菇又名蟹味菇、玉蕈、鸿禧菇等，其味比平菇鲜，肉比滑菇厚，质比香菇韧，口感极佳，还具有独特的蟹香味，在日本有“香在松茸、味在玉蕈”之说，是一种著名国际性药食兼用的珍稀食用菌，具有防止便秘、抗癌、防癌、提高免疫力、预防衰老、延长寿命等独特功效［1］。真菌多糖普遍都具有潜在的抗癌和免疫活性，而且其生物活性与分子结构有着非常密切的关系，对多糖的结构鉴定和抗癌免疫活性的研究是非常重要的［2］。真姬菇自20世纪80年代从日本引种至我国，目前我国已掌握了真姬菇生物学特性和栽培条件，真姬菇已成为我国食用菌工厂化生产的重要品种之一。然而我国由于引进真姬菇较晚，故对其研究尚不深入。目前国内大多针对真姬菇的生物学特性、栽培工艺、液态发酵条件、营养成分及加工工艺等方面进行研究。而对真姬菇多糖的研究，国内自2007年才见报道，并且大部分是对粗多糖提取工艺的研究［3－7］。目前国内对真姬菇相应的药理活性研究也主要针对粗多糖，且仅限于抗氧化活性［8］和抑菌活性［9］。本文提取分离纯化真姬菇多糖，并对纯化后的真机菇多糖进行分子结构特性鉴定和抗癌免疫活性的研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

真姬菇 购于上海大山合菌物科技股份有限公司;醋酸纤维素膜 英国沃特曼公司产品;葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖 Fluka公司;DEAE sepharose fast flow离子交换树脂 Phamacia公司产品;胎牛血清、RPMI－1640培养基 美国Gibco公司;水溶性四唑盐(WST－1)瑞士Roche公司;Raw 264.7细胞、人胃腺癌细胞(AGS)、结肠腺癌细胞(DLD－1)、子宫颈癌细胞(HeLa)美国标准生物品收藏中心(ATCC);其余试剂均为国产分析纯。

高效液相色谱(配置2414示差折光检测器)美国Waters公司;Bruker Agilent 6890N气谱质谱联用仪 美国安捷伦科技有限公司;十八角激光光散射仪及ASTRA 5.3工作站 美国Wyatt技术公司;EL－800酶联检测仪 美国BioTek公司。

1.2 实验方法

1.2.1 真姬菇子实体粉的预处理 去杂、烘干(60℃，24h)、粉碎、过筛(100 目)、备用(－20℃)。

1.2.2 真姬菇子实体多糖的提取纯化 称取真姬菇子实体粉末100g，加入80%乙醇，于60℃水浴回流脱脂2h，残渣中加适量水(水料比1∶20)，100℃水浴提取2次，每次2h，过滤，合并滤液，加入氯仿－正丁醇(4∶1)，充分震荡 30min，5000r/min 离心 20min，取上层水相重复除蛋白10次以上，取上清液装入透析袋内，先用自来水流动透析48h，再用蒸馏水透析24h后，浓缩，真空冷冻干燥，即得真姬菇粗多糖(HMP)。

溶解真姬菇多粗糖HMP，上样后分别用蒸馏水及不同浓度NaCl溶液洗脱，流速1.5mL/min。收集洗脱液(30min/管)，用硫酸苯酚法检测［10］，合并相同流分，浓缩，透析，真空冷冻干燥，得不同多糖级分。

1.2.3 真姬菇子实体多糖的均一性和平均分子质量的测定 采用高效分子排阻色谱法(HPSEC)对真姬菇多糖进行均一性及分子质量的测定。溶解多糖，醋酸纤维素膜(3.0μm pore size)过滤，注入高效凝胶尺寸排阻色谱－十八角激光散色仪－示差检测仪联用(HPSEC－MALLS－RI)系统，高效凝胶排阻色谱为三个色谱柱串联:TSK G5000 PW(7.5×600 mm)、TSK G3000 PWxl(7.8×300mm)、TSK G2500PWxl(7.8×300mm)，流动相:0.15mol/L NaNO3和 0.02%NaN3，流速:0.4mL/min。多糖的平均分子量可根据MALLS和RI检测器收集的数据，通过ASTRA 5.3软件直接计算。

1.2.4 单糖含量测定 称取5mg真姬菇子实体多糖于安培瓶中，加入2mol/L三氟乙酸(TFA)2mL，120℃水解2h后，水解液减压浓缩至干，再加甲醇3mL蒸干，重复3次，除尽TFA。加入适量水溶解，水解产物经0.45μm微孔膜过滤后，取滤液20μL注入HPLC系统测定进行测定，糖分析色谱柱(4.6×250mm)，流动相为乙腈与水混合物(80∶20)，流速2mL/min。

1.2.5 糖苷键连接方式分析 多糖2～3mg，0.5mL DMSO溶解后，加入0.3mL的CH3I和NaOH(20mg)进行甲基化，经4mol/L的 TFA水解(100℃，6h)，NaBD4还原，醋酸酐乙酰基化后，衍生物注入气相色谱－质谱联用(GC－MS)检测。GC－MS色谱柱为HP－5柱(30m ×0.25mm，0.25μm)，程序升温条件:初始温度/停顿时间为160℃/2min，程序升温终止温度/停顿时间240℃/10min，升温速率5℃/min。

1.2.6 对癌细胞的抑制作用 取对数生长期的人胃腺癌细胞(AGS)、结肠腺癌细胞(DLD－1)、子宫颈癌细胞(HeLa)，于RPMI－1640(含10%胎牛血清)培养基中，以1×105个/mL的细胞悬液接种于96孔培养板，每孔200μL，置37℃、5%CO2培养箱培养24h后吸取上清液弃去，用磷酸缓冲液(PBS)洗1～2遍，加入不含小牛血清的浓度分别为10、100、500、1000μg/mL 真姬菇多糖样品，每个浓度设3个平行，继续培养48h后，加入 20μL WST－1，培养 4h，450nm 下测 OD 值，按以下公式计算癌细胞抑制率:

其中 As是实验组 OD值，Ac是空白对照组OD值。

1.2.7 真姬菇多糖对巨噬细胞的增殖作用 在96孔培养板中加入巨噬细胞 Raw 264.7(100μL，1×105个/mL;ATCC，Rockville，MD，USA)和浓度为 12.5、25、50、100 μg/mL 的多糖溶液(100μL)，在 CO2培养箱(37℃)中培养 72h，RPMI－1640(含 10% 胎牛血清)为培养基。空白对照加生理盐水。增殖作用采用WST－1法，按以下公式计算免疫细胞增殖率:

其中 As是实验组 OD值，Ac是空白对照组OD值。

1.2.8 真姬菇多糖对巨噬细胞NO释放的影响 取对数生长期的巨噬细胞，调整细胞浓度至1×106个/mL，接种于96孔细胞培养板，于37℃，5%CO2条件下培养，待细胞贴壁后，弃掉培养上清，加入多糖溶液或LPS(1μg/mL，阳性对照)。培养24h，分别取细胞培养上清(100μL)，与等体积的Griess试剂混合，避光反应10min，酶标仪540nm测吸收值。NO浓度参考NaNO2(1～200μmol/L)标准曲线计算。

1.2.9 数据处理实验数据采用¯x±s表示，应用SAS8.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析(ANOVA)和邓肯氏复极差(Duncan’s multiple－range test)法分析比较各实验组之间的差异。

2 结果与分析

2.1 真姬菇多糖HMP－3的分离纯化

真姬菇子实体粉末经水提取、醇沉、Sevag法脱蛋白得真姬菇子实体粗多糖(HMP)，HMP进一步经DEAE－Sepharose Fast Flow离子交换柱分离纯化，DEAE－Sepharose Fast Flow不仅具有离子交换功能，还具有较快的洗脱速度和良好的分子筛效应，对真姬菇多糖的洗脱曲线如图1所示，该粗多糖被分离为三个组分，将洗脱液浓缩、透析、冷冻干燥得白色絮状多糖 HMP－1、HMP－2、HMP－3，其中 HMP－1 和HMP－2较少，HMP－3为主要组分，对HMP－3进行分子结构和生物活性的研究。

表1 各单糖标准品的HPLC洗脱信息Table 1 HPLC elution information of standard monosaccharides

表2 HMP－3中单糖HPLC洗脱信息Table 2 HPLC elution information for monosaccharides of HMP－3

表3 HMP－3的GC－MS甲基化分析结果Table 3 Methylation analysis of HMP－3

图1 真姬菇多糖的DEAE－Sepharose Fast Flow色谱分离曲线Fig.1 Elution pattern of polysaccharides from Hypsizigus marmoreus on DEAE－Sepharose Fast Flow chromatography

2.2 HMP－3的均一性及分子量测定

多糖的纯度不能以通常小分子化合物的纯度标准来衡量，它是一种生物高分子化合物，其存在微观的不均一性。真姬菇多糖HMP－3的均一性及分子质量采用高效分子排阻色谱法(HPSEC)进行分析。从RI色谱图可知(图2)，HMP－3在HPSEC上得到一个单一对称峰，说明HMP－3为均一多糖组分。经MALLS技术测定HMP－3的平均分子量(Mw)为(7460±110)ku。HMP－3的回旋半径值(Rg)也通过MALLS计算出来以评估其分子尺寸，为(21.6±0.4)nm。从不同蘑菇中提取的水溶性多糖分子质量之间差异比较大，从1.1 ×104g/mol到 3.9 ×107g/mol不等［11－12］，这种巨大的差异不仅是由于蘑菇种类不同，也与提取纯化方法，分析检测技术及蘑菇所处的生长周期不同有关。

图2 RI检测仪检测的HMP－3分子排阻色谱图Fig.2 HPSEC chromatograms of HMP－3 from RI detector

2.3 单糖组成

HMP－3完全水解物与标准单糖的HPLC洗脱信息(表2、表3)对照表明:HMP－3由葡萄糖和半乳糖两种单糖组成。经面积归一法计算两种单糖含量得:葡萄糖的含量为80.18mg/g;半乳糖的含量为10.82mg/g。从菌核侧耳和平菇中提取的水溶性多糖也主要由葡糖糖(含量为73.1%～97.0%)和半乳糖(0.5% ～14.3%)组成［13－15］，其他单糖如果糖、木糖、甘露糖等在本研究中没有发现。

2.4 糖苷键连接方式分析

HMP－3经甲基化，酸水解、还原及乙酰化，生成甲基化糖醇乙酸酯衍生物，对其进行GC－MS分析，总离子图(TIC)如图3所示，质谱电离方式为EI源。

甲基化产物的GC－MS分析结果(表3)显示，甲基化糖醇衍生物中占绝大部分的为2，3，6－Me3－Glcp，这说明多糖HMP－3分子的主链可能主要是通过1，4糖苷键连接的葡糖糖组成。一种经DEAE－纤维素柱层析纯化的真姬菇多糖HPS－II也以(1，4)葡聚糖为主链，与我们的研究结果一致，虽然我们的纯化方法不尽相同［16］。同时由于衍生物中也有相当一部分的2，3，4－Me3－Glcp和2，3，4－Me3－Galp，说明其主链也包含了1，6糖苷键连接的葡萄糖或者半乳糖。在真姬菇同属的菌核侧耳和环柄侧耳多糖也由(1，4)葡萄糖构成主链，同时包含(1，6)葡萄糖或者半乳糖分支，与我们在研究发现的结构相似［17－18］。

表4 HMP－3对人细胞株的体外抑制作用Table 4 Anti－proliferative activity of HMP－3 in AGS cell lines

图3 HMP－3的总离子流图谱Fig.3 Chromatogram of HMP－3 on GC－MS total ion flow

2.5 抗癌活性测定

HMP－3 对 AGS、DLD－1、HeLa癌细胞的体外抑制率见表4。由表4可见，HMP－3对 AGS、DLD－1、HeLa的抑制率相对比较低(＜20%)而且无剂量依赖性。说明HMP－3对这三种癌细胞没有明显的细胞毒性。Ikekawa等人也曾报道过体外实验中真姬菇粗多糖对L－5178Y肿瘤细胞几乎没有细胞毒性［19］，与我们的研究结果吻合。菌核侧耳多糖和香菇多糖也对Sarcoma 180细胞和人肝癌细胞(HepG2)的体外抑制率(11% ～28%)较低［20－21］。然而，尽管体外抗癌活性低，真姬菇粗多糖和金福菇多糖在体内实验中表现出了高抗癌活性［19，22］。对于这些多糖为什么只在体内表现抗癌活性，目前机理并不明确，然而有迹象表明多糖可能是作为生物反应调节剂，通过刺激免疫细胞产生一氧化亚氮(NO)或者细胞因子来抑制癌细胞的生长［19，23］。

2.6 真姬菇多糖对巨噬细胞的增殖作用

小鼠巨噬细胞Raw264.7在LPS的刺激下会释放细胞因子，这一系统被用于测定某种成分是否对免疫系统具有调节活性［24］。因此，本实验以小鼠巨噬细胞 Raw264.7为细胞模型，考查了 HMP－3对Raw264.7细胞增殖及NO生成的影响，为活性多糖的免疫调节研究提供有价值的参考模式。本实验的研究发现，含有HMP－3(1～200μg/mL)的培养孔中，培养基颜色清澈，细胞透亮，长势良好。WST－1结果(图4)表明，HMP－3可促进Raw264.7细胞的增殖，HMP－3对Raw264.7无细胞毒作用。

图4 HMP－3对Raw264.7增殖率的影响Fig.4 Effect of HMP－3 on cell proliferation of Raw264.7 cells.

2.7 真姬菇多糖对巨噬细胞NO释放的影响

HMP－3对Raw264.7细胞中NO释放的影响如图5所示，由结果可知，巨噬细胞在不添加任何成分，也就是在静息状态下，释放的NO很少。添加HMP－3后，Raw264.7分泌NO的能力明显提高(p＜0.01)，生成的NO的量随HMP－3剂量的增加而增加，呈剂量依赖关系。当HMP－3在浓度为15μg/mL时，Raw264.7生成 NO的量为 33.51μmol/L，与 LPS中Raw264.7生成NO的量相似。NO水平是巨噬细胞激活的一个重要指标，巨噬细胞抗病毒、抗肿瘤、抑制胞内病原体增殖等作用主要都是通过释放NO实现［25］。HMP－3显著增加了巨噬细胞释放NO的能力，说明HMP－3是巨噬细胞免疫调节物质，具有免疫调节活性。

图5 HMP－3对巨噬细胞Raw264.7中NO的影响Fig.5 Effect of HMP－3 on NO production in mouse peritoneal macrophage Raw264.7 cells

3 结论

从真姬菇中提取生物活性成分真姬菇多糖，经离子交换柱层析分离纯化得到组分HMP－3;HMP－3主要由葡萄糖和半乳糖构成，相对分子量为(7460±110)ku，分子回旋半径值为(21.6±0.4)nm;经甲基化和GC－MS初步分析其结构，HMP－3主链主要由(1，4)葡萄糖构成，含有少量(1，6)葡萄糖或(1，6 半乳糖);体外实验表明，HMP－3虽对 AGS、DLD－1和HeLa癌细胞无明显的细胞毒性，但对小鼠巨噬细胞有强烈的激活作用，具有免疫活性，可以作为免疫调节剂应用于医药、卫生或者保健食品中。

［1］孙培龙，魏红福，杨开，等.真姬菇研究进展［J］.食品科技，2005，9:54－57.

［2］Zhang M，Cui S W，Cheung P C K，et al.Antitumor polysaccharides from mushrooms:a review on their isolation process，structural characteristics and antitumor activity［J］.Trends in Food Science ＆ Technology，2007，18:4－19.

［3］姜华，蔡德华，张华卫.真姬菇子实体粗多糖提取条件实验［J］.食用菌，2007，3:55－56.

［4］李顺峰，刘兴华，张丽华，等.真姬菇子实体多糖的提取工艺优化［J］.农业工程学报，2008，24(2):281－284.

［5］付娟妮，刘兴华，蔡福带，等.真姬菇菌丝体多糖碱提取工艺优化［J］.农业机械学报，2008，39(6):98－101.

［6］张俊刚，徐颖，赵清珍，等.真姬菇子实体多糖提取条件正交实验研究［J］.安徽农业科学，2008，36(21):9125－9191.

［7］周浩.真姬菇多糖的提取和组分研究［J］.安徽农业科学，2009，37(30):14879－14880.

［8］李顺峰，郑丽华，付娟妮，等.真姬菇子实体多糖体外抗氧化特性研究［J］.西北农业学报，2008，17(4):302－305.

［9］王耕.真姬菇液体培养条件的优化及多糖提取与分析［D］.福州:福建农林大学，2009.

［10］Dubois M，Gilles K A，Hamilton J K，et al.Colorimetry method for determination of sugars and related substances［J］.Analytical Chemistry，1956，28:350－356.

［11］Synytsya A，Mickova K，Synytsya A，et al.Glucans from fruit bodies of cultivated mushrooms Pleurotus ostreatus and Pleurotus eryngii:Structure and potential prebiotic activity［J］.Carbohydrate Polymers，2009，76:548－556.

［12］Yang C，Chung D，You S G.Determination of physicochemical properties of sulphated fucans from sporophyll of Undaria pinnatifida using light scattering technique［J］.Food Chemistry，2008，111:503－507.

［13］Santos－Neves J C，Pereira M I，Carbonero E R，et al.A novel branched αβ－glucan isolated from the basidiocarps of the edible mushroom Pleurotus florida［J］.Carbohydrate Polymers，2008，73:309－314.

［14］Zhang M，Zhang L，Cheung P C K，et al.Molecular weight and anti－ tumor activity of the water－ soluble polysaccharides isolated by hot water and ultrasonic treatment from the sclerotia and mycelia of Pleurotus tuber－regium［J］.Carbohydrate Polymers，2004，56:123－128.

［15］Zhang M，Zhang L，Cheung P C K，et al.Fractionation and characterization of a polysaccharide from the sclerotia of Pleurotus tuber－regium by preparative size－exclusion chromatography［J］.Journal of Biochemical and Biophysical Methods，2003，56:281－289.

［16］姜华，纪春暖，陈健，等.真姬菇多糖的分离纯化及结构分析［J］.食品科技，2008，33(12):204－207.

［17］Tao Y，Zhang L.Characterization of polysaccharide－protein complexes by size－exclusion chromatography combined with three detectors［J］.Carbohydrate Research，2008，343:2251－2257.

［18］Roy S K，Maiti D，Mondal S，et al.Structural analysis of a polysaccharide isolated from the aqueous extract of an edible mushroom，Pleurotus sajor－ caju，cultivar Black Japan［J］.Carbohydrate Research，2008，343:1108－1113.

［19］Ikekawa T，Saitoh H，Feng W，et al.Antitumor activity of hypsizigus marmoreus.Ⅰ.Antitumor activity of extracts and polysaccharides［J］.Chemical and Pharmaceutical Bulletin，1992，40(7):1954－1957.

［20］Tao Y，Zhang L，Cheung P C K.Physicochemical properties and antitumor activities of water－soluble native and sulfated hyperbranched mushroom polysaccharides［J］.Carbohydrate Research，2006，341:2261－2269.

［21］Maeda Y Y，Watanabe S T，Chihara C，et al.Denaturation and renaturation of a β－1，6;1，3－ glucan，lentinan，associated with expression of T － cell－ mediated responses［J］.Cancer Research，1988，48:671－675.

［22］Liu F，Ooi V E C，Liu W K，et al.Immunomodulation and antitumor activity of polysaccharide－protein complex from the culture filtrates of a local edible mushroom，Tricholoma lobayense［J］.General Pharmacology，1996，27:621－624.

［23］Liu C，Xi T，Lin Q，et al.Immunomodulatory activity of polysaccharides isolated from strongylocentrotus nudus eggs［J］.International Immunopharmacology，2008，8:1835－1841.

［24］Porcheray F，Viaud S，Rimaniol A C，et al.Macrophage activation switching:an asset for the resolution of inflammation［J］.Clinical＆ Experimental Immunology，2005，142:481－489.

［25］Jiao L，Li X，Li T，et al.Characterization and anti－ tumor activity of alkali－extracted polysaccharide from Enteromorpha intestinalis［J］.International Immunopharmacology，2009，9:324－329.