碎冰冷藏对罗非鱼肌原纤维蛋白理化特性的影响

王 瑛，周春霞，洪鹏志，刘慧清

（广东省水产品加工与安全重点实验室，广东普通高等学校水产品深加工重点实验室，广东海洋大学食品科技学院，广东湛江，524088）

我国是罗非鱼的养殖大国，也罗非鱼的消费大国和贸易大国。2008年我国罗非鱼出口量为22.4万t，占我国水产品贸易的第二位，2011年罗非鱼的出口量高达33万[1]。由于其水分含量高，肌肉细嫩，死后很容易在微生物和酶的作用下发生变质，且鱼的收获期相对集中，鲜活销售量有限，捕获后的产品如不采取适当的贮藏措施会严重影响其市场流通和销售。目前，水产品的保鲜方式主要有冷藏保鲜、冷海水保鲜、冰温保鲜、微冻保鲜、冷冻保鲜和超冷快速保鲜。但是冷海水保鲜将鱼体在冷海水中浸泡，鱼体会因渗盐吸水而膨胀，且鱼肉略带咸味，表面变色，鱼肉蛋白容易损失，在以后的流通过程中容易提早腐烂；冰温保鲜能利用的温度区间很小，要求严格；微冻保鲜要求的温度处于最大冰晶生成带内，容易引起蛋白质变性；冷冻保鲜和超冷快速保鲜适用于罗非鱼的长期贮藏。冰藏保鲜是以冰为介质，将鱼体的温度降低至接近冰的融点。由于冰容易得到，冷却能力大，与鱼体接触无害，价格便宜，便于携带，因此长期以来被用于水产品的保鲜[2]。但是虽然低温能抑制酶的活性、微生物的生长，但在保鲜过程中依然伴随着糖原分解、脂肪氧化、蛋白质变性等现象的发生[3]。分析现有水产加工品的构成，冷冻和冷藏加工品仍是最重要的组成部分，占了一半以上，但是关于冰藏期间罗非鱼肉肌原纤维蛋白理化特性的变化的研究很少。本文主要探讨了碎冰冷藏法对罗非鱼肉肌原纤维蛋白理化特性的影响，进一步提高鱼类贮藏的技术，以期望为罗非鱼的贮藏、运输和销售提供理论参考，同时为构建罗非鱼品质评价体系提供相关依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

罗非鱼 购于湛江市湖光市场；ANS Sigma公司，色谱纯；5’-ATPNa2上海源叶生物科技有限公司，分析纯；乙二胺四乙酸、三羟甲基氨基甲烷、二硫代二硝基苯甲酸、米吐尔等 广州化学试剂厂，分析纯。

RF-5301P型荧光分光光度计、UV-2550型紫外可见分光光度计 日本岛津公司；CR22GⅡ型高速速冻离心机 日本日立有限公司；FJ-200型高速分散均质机 上海标本模型厂。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的预处理 鲜活罗非鱼每尾重约1kg，1h内用冰保鲜运回广东海洋大学水产品重点加工实验室后，除去内脏和鱼腮，清洗干净后置于封口袋中，每3尾为一组，于封闭泡沫箱中加碎冰保存，下层冰厚约10cm，上层厚约5cm，每24h换冰一次，分别于冰藏第0、1、2、3、4、6、8、10、12、15d取样测定。

1.2.2 pH的测定 按照GB/T 9695.5-2008肉与肉制品pH测定的方法进行。取10g罗非鱼肉置于100mL 0.1mol/L的 KCl溶液中，匀浆20s后，直接用pH计进行测定，待读数稳定后读取数值。

1.2.3 肌原纤维蛋白溶液的制备 肌原纤维蛋白溶液的提取参考万建荣[4]的方法，并稍作修改：取200g碎鱼肉样品，添加4倍量的冰水，充分匀浆，然后在8000r/min下低温（4℃）离心20min，重复3～5次后在沉淀中加入4倍量的0.1mol/L磷酸盐缓冲液（0.6mol/L KCl，pH7.0），匀浆，于0～4℃的环境中提取18h，在4℃，8000r/min下离心20min，收集上清液，用双缩脲法测定蛋白含量。

1.2.4 活性巯基的测定方法 活性巯基含量的测定参考Ellman[5]法，采用DTNB法测定。

1.2.5 Ca2+-ATPase活性的测定 Ca2+-ATPase活性的测定参考Benjakul的方法[6]。

1.2.6 表面疏水性的测定 采取的ANS荧光探针法[7]，检测的激发波长和发射波长分别为380nm和480nm，狭缝宽为5nm。以相对荧光强度与蛋白质浓度作图，其初始斜率即为蛋白质的相对表面疏水性（ANS-S0）。

1.2.7 乳化性的测定 采用浊度法[8]测定肌原纤维蛋白的乳化活性（EAI）和乳化稳定性（ESI）。

1.2.8 感官评定 将冰藏后的罗非鱼感官评价人员即时进行评测[9]，评定人员由10位经过培训的专业人员组成，分别对鱼片的色泽、气味、组织形态和肌肉弹性进行评定。鱼体的综合分值在15～20分为一级鲜度，9～15分为二级鲜度，8分以下为不新鲜。

1.2.9 数据分析 每个实验样品测定重复3～5次，用Origin 7.5进行数据处理，其值表示为：平均值±标准差。

2 结果与讨论

2.1 碎冰冷藏对罗非鱼肉pH的影响

图1 冰藏对罗非鱼肉pH的影响Fig.1 Effect of iced storage on the pH value of Tilapia muscle

在碎冰冷藏期间，罗非鱼肌肉pH的变化如图1所示。由图1可知，在实验范围内，随着冰藏时间的延长，其pH呈现先下降后上升的趋势，于冰藏的第2d达到最低点（pH6.67），很可能与鱼体糖酵解过程有关。鱼体停止呼吸后，组织呼吸转变为无氧的糖酵解途径，糖原分解产生乳酸，所以pH下降，但是随着贮藏时间的延长，罗非鱼体内肌原纤维蛋白不断降解，分解产生碱性物质，使得pH又升高[10]。

2.2 碎冰冷藏对罗非鱼肉肌原纤维蛋白含量的影响

碎冰冷藏期间罗非鱼肌原纤维蛋白含量的变化如图2所示。冰藏期间，肌原纤维蛋白含量随贮藏时间的延长呈现先上升后下降的趋势。由图2可知，新鲜罗非鱼的肌原纤维蛋白的提取量并不是最高的，冰藏1d后提取量最大，高达135.73mg/g。这是由于罗非鱼刚死后，其肌肉内ATP的作用，使得肌球蛋白分子与肌动蛋白分子呈不可逆的强固结合，相互聚合形成了分子量较大的分子，在离心时沉降至沉淀部分[11]。冰藏第1～10d一直呈现迅速下降的趋势，贮藏末期趋于平缓。肌原纤维蛋白含量逐渐降低主要是由于冰藏过程中蛋白质变性发生交联反应，巯基氧化形成的二硫键会导致肌球蛋白重链发生聚合[12]。

表1 罗非鱼肉的感官评价标准Table 1 Criteria of sensory evaluation of Tilapia muscle

图2 冰藏对罗非鱼肉肌原纤维蛋白含量的影响Fig.2 Effect of iced storage on content of myofibrillar protein from Tilapia muscle

2.3 碎冰冷藏对罗非鱼肉肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性的影响

图3 冰藏对罗非鱼肉肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性的影响Fig.3 Effect of iced storage on the activity of Ca2+-ATPase of myofibrillar protein from Tilapia muscle

Ca2+-ATPase活性被广泛用于表示肌球蛋白完整性的指标。在碎冰冷藏期间，罗非鱼肉肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性的变化如图3所示。由图3可知，冰藏期间，罗非鱼肉肌原纤维蛋白的Ca2+-ATPase活性随着贮藏时间的延长呈下降趋势，其中前6d下降较为迅速，从开始的0.42μmolPi/mg·min迅速降至0.18μmol Pi/mg·min，之后变化趋于平缓。引起Ca2+-ATPase活性下降的原因主要为pH下降以及巯基氧化形成二硫键导致的分子聚合；可能是由于肌浆球蛋白的球状头部构象的变化以及这部分蛋白的聚集或者相互作用发生重排导致的[13]。

2.4 碎冰冷藏对罗非鱼肉肌原纤维蛋白活性巯基含量的影响

在碎冰冷藏期间，罗非鱼肉肌原纤维蛋白活性巯基含量的变化如图4所示。由图4可知，冰藏期间，罗非鱼肌肉中肌原纤维蛋白活性巯基的含量随着贮藏时间的延长呈现下降的趋势。其中前6d活性巯基含量下降较快，从开始的9.34×10-5mol/g迅速下降至3.34×10-5mol/g，之后变化趋于平缓。巯基含量的变化主要是肌球蛋白降解，蛋白质空间结构发生改变，使埋藏在分子内部的巯基暴露出来被氧化，导致其含量减少[6]。

图4 冰藏对罗非鱼肉肌原纤维蛋白活性巯基的影响Fig.4 Effect of iced storage on the activity of sulfhydryl of myofibrillar protein from Tlapia muscle

2.5 碎冰冷藏对罗非鱼肉肌原纤维蛋白表面疏水性的影响

图5 冰藏对罗非鱼肉肌原纤维蛋白表面疏水性的影响Fig.5 Effect of iced storage on the surface hydrophobicity of myofibrillar protein from Tilapia muscle

ANS是所用疏水探针中应用最广泛的探针，它通过非共价的形式结合到蛋白质分子的非极性区域，增强了荧光强度。在一定范围内，荧光强度与蛋白质的浓度具有较好的线性关系[7]，这表征了蛋白质疏水性基团的暴露情况。

在碎冰冷藏期间，罗非鱼肉肌原纤维蛋白表面疏水性的变化如图5所示。由图5可知，冰藏期间，肌原纤维蛋白的表面疏水性呈上升趋势，但是前4d上升较缓慢，第6～8d迅速上升，第8d后趋于平缓。冰藏期间，疏水性发生变化是由于不同氨基酸间的疏水作用及巯基的氧化影响了蛋白质的疏水性；且由于蛋白质的降解和变性作用，会使埋藏在内部的分子暴露出来，导致疏水性增加[13]。

2.6 碎冰冷藏对罗非鱼肌原纤维蛋白乳化性的影响

图6 冰藏对罗非鱼肉肌原纤维蛋白乳化活性和乳化稳定性的影响Fig.6 Effect of iced storage on the emulsifying activity and emulsifying stability of myofibrillar protein from Tilapia muscle

在碎冰冷藏期间，罗非鱼肉肌原纤维蛋白乳化性的变化如图6所示。由图6可知，冰藏期间肌原纤维蛋白的EAI和ESI均呈下降趋势，其中前6d下降较缓慢，后期则迅速下降，贮藏时间在0～16d分别从41.24m2/g和44.78min下降至10.48m2/g和16.39min。蛋白质的乳化特性是蛋白质与蛋白质、蛋白质与脂肪交联能力的表征，乳化性受蛋白质的空间构象、聚集程度、pH、离子强度、粘度等一系列因素的影响，其中蛋白质的空间构象及其聚集程度影响最大[14]。而且有关研究也表明，蛋白质的乳化能力与溶解度呈正相关，即蛋白质的含量越高，其乳化能力越好[15]。在冰藏过程中，罗非鱼体内肌原纤维蛋白不断发生变性降解，导致蛋白质分子空间构象发生变化，且蛋白质含量逐渐降低，因而乳化性和乳化稳定性逐渐降低。

2.7 碎冰冷藏对罗非鱼肌肉感官的影响

图7 冰藏对罗非鱼肌肉感官分值的影响Fig.7 Effect of iced storage on the sensory evaluation value of Tilapia muscle

在碎冰冷藏期间，罗非鱼肉肌原纤维蛋白感官的变化如图7所示。综合感官评分在冰藏期间随着冰藏时间的延长而越来越低。在冰藏的前6d，鱼肉一直保持着一级鲜度的状态；冰藏的前10d内，其品质也一直保持新鲜的状态，仍然可以食用；但是在冰藏后期其肌肉呈现腐败的迹象，主要表现为颜色变暗，肉质松散，并且有不良气味的生成，不宜食用。因此碎冰冷藏对于罗非鱼的短期贮藏效果很好，为罗非鱼的贮藏、运输和销售提供了理论依据。另外，冰藏期间，由于微生物和酶的作用，罗非鱼体内蛋白质会逐渐降解变性，导致硫化氢、氨、甲硫醇、腐胺、尸胺、吲哚、四氢吡咯院等化合物的生成，导致颜色变暗并呈现异味；鱼体之所以会变软的原因主要有两种说法：一种认为冷藏过程中，由于某种生化变化使结缔组织的机械强度下降，导致鱼肉软化；也有人认为与肌原纤维的Z盘的脆弱化、肌动球蛋白复合体的解离、肌联蛋白的结构变化或者结缔组织的变性有关[2]。

3 结论

通过对冰藏条件下对罗非鱼pH、肌原纤维蛋白的蛋白质含量、Ca2+-ATPase活性、活性巯基含量、乳化性和感官品质等理化特性影响的研究，发现罗非鱼的pH在冰藏期间呈现先下降后上升的趋势；肌原纤维蛋白溶出量则呈现先上升后下降的趋势；Ca2+-ATPase活性、巯基含量、乳化性以及感官评价均随着贮藏时间的延长而逐渐降低；表面疏水性则随着贮藏时间的延长而逐渐升高；通过感官评定发现贮藏前6d内罗非鱼的品质一直处于一级鲜度的状态，并且到第10d品质仍保持新鲜，可以食用。

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