反丁烯二酸水杨酸甲酯的合成及抑菌活性研究

胡鑫鑫, 董 利，陈颖峰，黄小翰

( 茂名职业技术学院 化学工程系，广东 茂名 525000)

对食品防腐剂的构效关系进行了大量研究后发现，α、β-不饱和羰基结构是防腐剂发挥抗菌作用的功能基团[1]。富马酸及其酯类衍生物即是一种含有该官能团的高效、广谱抗菌防腐剂。其中, 富马酸二甲酯(DMF)即是一个具有代表性的富马酸酯类衍生物，但由于富马酸二甲酯易升华、刺激性气味重，且对人皮肤和黏膜具有强烈的刺激作用，因而限制了其在食品方面的应用。为消除富马酸二甲酯的过敏性及升华性, 并保留其α、β不饱和羰基功能结构，本研究在富马酸分子的一端引入水杨酸甲酯，使其羧基与其酯化，另一端羧基引入甲醇，使其甲酯化，合成出新型防腐剂反丁烯二酸水杨酸甲酯(Methyl Salicylate Methyl Fumarate, MSMF)，对合成产物进行表征，并对其抗菌活性进行研究，同时与目前常用的抗菌剂进行比较。

1 实验材料与仪器

(1) 实验药品：无水甲醇、顺丁烯二酸酐、无水AlCl3、水杨酸甲酯、乙醇、二氯亚砜、氢氧化钠、溴化钾、碳酸氢钠（以上试剂均为分析纯）；营养肉汤、培养基蛋白胨、麦芽汁、葡萄糖、琼脂牛肉膏（以上均为生化试剂）。

(2) 供试菌种：大肠杆菌(Eschericheae coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerivisiae)、面包酵母(Saccharomyces panis fermentati)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黄曲霉(Aspergillus flavous)（以上菌种由茂名职业技术学院微生物实验室提供）及牛奶酸败混合菌群（室温贮存牛奶酸败后分离所得）。

(3) 供试抗菌剂：苯甲酸钠、苯甲酸、山梨酸钾、山梨酸、尼泊金甲酯、丙酸钙（以上试剂均为食品级），反丁烯二酸水杨酸甲酯（自己合成）。

(4) 实验仪器： JB50-D 増型 力电动搅拌机，DGSY电热恒温水浴锅， THZ -82型恒温振荡器，PHS-25型pH计，X-4型显微熔点仪（温度计未校正），手提式压力蒸汽灭菌器， AVATAR360FT红外光谱仪，UV2401PC型紫外-可见分光光度计。

(5) 细菌培养基的制备：营养肉汤培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、葡萄糖10 g、水1 000 mL、调节pH至7.6～7.8，121 ℃灭菌30 min，用于枯草杆菌、培养[2]；麦芽汁培养基：取130 g麦芽汁培养基溶于1 000 mL蒸馏水中，约达12°Bx，加入琼脂20 g煮沸使琼脂充分溶解，121 ℃灭菌30 min，用于酵母培养。

2 反丁烯二酸水杨酸甲酯合成与表征

2.1 反丁烯水杨酸甲酯的合成

2.1.1 合成原理

以顺丁烯二酸酐、水杨酸甲酯和甲醇为原料，采用三步反应合成目标产物反丁烯二酸水杨酸甲酯：第一步，顺酐在加热条件下先与甲醇酯化，再经无水AlCl3异构化后生成反丁烯二酸单甲酯；第二步，加入二氯亚砜使反丁烯二酸单甲酯酰氯化，生成反丁烯二酸单甲酯单酰氯；第三步，反丁烯二酸单甲酯单酰氯再与甲醇酯化得到反丁烯二酸水杨酸甲酯。合成路线见图1[2-5]。

图1 反丁烯二酸水杨酸甲酯的合成路线Fig.1 Synthetic route of MSMF

2.1.2 操作步骤

在装有温度计、回流冷凝管和电动搅拌器的250 mL三口烧瓶中按1.0︰1.1的配比加入顺丁烯二酸酐和无水甲醇，水浴加热，在 60 ℃条件下搅拌反应30 min，然后升温至80 ℃后加入占反应物总质量3%异构化催化剂无水AlCl3，保温反应2 h。冷却至室温，用饱和KHCO3溶液溶解、过滤，滤液加浓盐酸中和至 pH=3～4，析出白色固体，抽滤、水洗，用80 ℃的 20%乙醇－水溶液重结晶，45 ℃真空干燥24 h，得白色片状晶体即反丁烯二酸单甲酯[6]。

在通风橱中，向装有回流冷凝管（冷凝管上端接氯化钙干燥管，尾气通入0.2 kg/L NaOH 溶液中）的100 mL的圆底烧瓶中，按摩尔比为1.0︰2.2的比例加入反丁烯二酸单甲酯和氯化亚砜，油浴加热回流 45 min。反应结束后，常压蒸出未反应的亚硫酰氯后减压蒸馏，减压蒸馏收集118～122℃/0.09 MPa馏分，得到无色透明油状液体反丁烯二酸单甲酯单酰氯[7]。

在装有电磁搅拌、温度计、恒压滴液漏斗的三口烧瓶中，加入水杨酸甲酯，冰水浴下缓慢滴加一定量的反丁烯二酸单甲酯单酰氯，反应30 min。将反应液滴加到饱和 NaHCO3溶液中，分离上层析出的淡黄色蜡状物，水洗至中性，再用80 ℃的20%乙醇－水溶液重结晶所得晶体真空干燥即为产品。

2.2 产物表征

2.2.1 熔点测定

X-4型显微熔点仪测得反丁烯二酸水杨酸甲酯熔点为125～126 ℃。

2.2.2 紫外光谱法

将待测试样配成一定浓度的乙醇溶液，利用UV2401PC型紫外-可见分光光度计检测样品的紫外吸收特性。样品在219 nm处有强吸收带，这是α、β不饱和羰基结构的特征吸收，同时在297 nm处有一强且宽的吸收峰，可以推测这是芳香族化合物特征吸收[8]。

2.2.3 红外光谱法

用 VECTOR33FT-IR红外光谱仪测定反丁烯二酸水杨酸甲酯的红外谱图，采用溴化钾压片，红外谱图见图2，特征吸收峰及可能对应的官能团见表1。

图2 反丁烯二酸水杨酸甲酯红外光谱图Fig. 2 IR spectrogram of MSMF

表1 反丁烯二酸水杨酸甲酯的红外吸收特征值Table 1 IR Spectrum of MSMF

3 反丁烯水杨酸甲酯的抑菌活性研究

3.1 最低抑菌浓度（MIC）测定

用试管稀释法测定细菌的MIC，用平板涂布法测定酵母及霉菌的MIC[9]。结果见表2。

表2 MSMF对各菌种的最低抑菌浓度Table 2 The MIC of and several other preservatives

通过表2可看出，反丁烯二酸水杨酸甲酯的抑菌普较广，对这不同的细菌、酵母及霉菌均有较强的抑制作用，且对上述菌种的最低抑菌浓度明显低于常用抗菌剂苯甲酸和山梨酸。

3.2 不同防腐剂对各菌种的生长抑制

用比浊法测定对细菌和酵母的生长抑制试验，用干重法对霉菌的生长抑制[9]。实验结果见图2-图6。

图3 对大肠杆菌的抑菌率曲线Fig.3 Effect on growth rate of Escherichia coli

图4 对枯草杆菌的抑菌率曲线Fig.4 Effect on growth rate of Bacillus subtilis

图5 对面包酵母的抑菌率曲线Fig.5 Effect on growth rate of Saccharomyces fermentati

图2 和图3为分别添加0.05%的反丁烯二酸水杨酸甲酯、苯甲酸、山梨酸及富马酸二甲酯对大肠杆菌和枯草杆菌的抑菌率曲线。由图可以看出MSMF对大肠杆菌和对枯草杆菌的抑菌半衰期大约均为36 h左右，对细菌的抑菌效果明显优于苯甲酸和山梨酸，与富马酸二甲酯接近。

啤酒酵母和面包酵母是酵母中的典型菌种，广泛分布在食品原料及土壤中。实验研究了添加量为0.05%时四种供试防腐剂对啤酒酵母和面包酵母的抑菌率曲线，结果如图4、图5所示。由图可知，20 h后，反丁烯二酸水杨酸甲酯的抑菌率仍然在90%以上，40 h后抑菌率仍然可达50%，其抑菌半衰期长达40 h以上，对酵母的抑菌效果远优于苯甲酸和山梨酸，略优于富马酸二甲酯。

图6 对啤酒酵母的抑菌率曲线Fig.6 Effect on growth rate of Saccharomyces cerivisiae

图7 反丁烯二酸水杨酸甲酯对黑曲霉的抑菌率曲线Fig.7 Effect of MSMF concentration on Aspergillus niger growth amount

图7 为反丁烯二酸水杨酸甲酯及几种常用防腐剂对黑曲霉的抑菌率曲线，从图中可看出，反丁烯二酸水杨酸甲酯的抑菌半衰期长达140 h以上。而在60 h后，苯甲酸、山梨酸、DMF、MSMF的抑菌率分别为48%、53%、76%和94%，120 h后，前三者抑菌率分别下降到9%、25%、44%，反丁烯二酸水杨酸甲酯的抑菌率仍可高达62%，说明MSMF对霉菌有较强的抑制作用，抑菌效果优于对照组3种常用防腐剂。

3.3 不同pH条件下食品防腐剂抑菌效果比较

目前市场现有各种食品防腐剂种类多为酸型防腐剂，只有在pH=4.5~3.5范围内才能有良好的抗菌效果，在中性或碱性条件下无任何抗菌效能，因此其使用范围受到较大的限制。此实验结果表明，反丁烯二酸水杨酸甲酯不但杀菌谱广，杀灭微生物种类多，且不受食品酸碱性的影响（见表3、表4）。这对扩大应用范围极为有利，因此，MSMF具有极为广阔的应用推广前景[10-12]。

表3 不同pH条件下GSMF与常用食品防腐剂抑菌效果（MIC值）比较Table 3 The antimicrobial capability of antiseptic in different pH %

3.4 反丁烯二酸水杨酸甲酯的耐热性研究

取直径为2 cm的滤纸圆片若干片，侵入0.1%的MSMF溶液中，半分钟后取出、晾干，然后置于温度为 100 ℃的干燥箱中，加热处理，于不同时间分别取出滤纸圆片，置于带有牛奶腐败混合菌的细菌培养基平板中央，于(28±1)℃的恒温培养箱中培养 48 h，观测抑菌圈直径的大小[10]。实验结果见表5。

表5 MSMF的耐热性实验Table 5 Heat resistance results of the MSMF

含有MSMF的滤纸片在100 ℃下处理2 h、4 h和6 h后对供试菌群的抑菌圈直径较未进行热处理的略有减小，其中，经热处理2 h后的抑菌圈直径为2.8 cm，经热处理4 h和6 h后的抑菌圈直径均为2.5 cm，与未经加热处理的含的滤纸片抑菌圈直径2.8 cm相近，这表明受热不易分解，不升华，热稳定性较好。

4 结束语

以顺酐、水杨酸甲酯和甲醇为原料，合成反丁烯二酸水杨酸甲酯的方法为：顺酐经甲酯化后异构化得到反丁烯二酸单甲酯，单甲酯酰氯化后得到反丁烯二酸单甲酯单酰氯，再与水杨酸甲酯酯化后即可得到目标产物反丁烯二酸水杨酸甲酯。

抑菌实验表明：（1）反丁烯二酸水杨酸甲酯不但抑菌谱较广，对常见的细菌、酵母、霉菌均有较强的抑制作用，且抑菌效果明显优于常用防腐剂苯甲酸和山梨酸；（2）反丁烯二酸水杨酸甲酯抑菌效果不受环境酸碱度、温度影响，在不同pH值、温度下均能有效杀灭细菌。

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