平车前无性系建立的研究

王晓旭，夏鸿飞，李 慧，姜长阳

(辽宁师范大学生命科学学院，辽宁大连 116081)

平车前(Plantago depressa)又名大叶车前、车轮菜、牛舌草等，为车前科车前属多年生草本植物。平车前为临床上的常用中药，全草和种子均可入药［1］。平车前有清热、利尿、明目、祛痰等功效，用于治疗小便黄少、暑湿泄泻、尿路感染、目赤涩痛、痰多咳嗽等疾病［2－3］。现代研究证实，平车前除具有以上功效外，还具有止泻护肝、降压、抑菌、降低血清胆固醇等多种药理作用［4］。在临床上平车前主要用于治疗水肿、慢性活动性肝炎、隐匿性肾炎［5］、阴道炎等症。此外，平车前还可作为野菜食用和畜禽的青饲料。车前属植物多数分布于受人为干扰强烈的生境中，是理论生态学、生理生态学、进化生物学研究的理想材料［6］。研究者的调查发现，由于平车前具有重要的药用、食用和饲用价值，多年来的大量采挖和生存环境的破坏，导致近年来野生平车前资源的分布和数量都急剧减少，现在，在大连郊区已经很难采到野生平车前。因此，寻求平车前快速繁殖的方法显得尤为重要。此前已有许多关于车前植物的研究报道［7－12］，多集中于其药用价值及成分分析方面，迄今未见平车前无性系建立的报道。本次试验针对平车前愈伤组织增殖和分化进行研究，筛选出适合平车前无性系建立的最佳条件，进而建立平车前的无性系，有利于平车前的大量繁殖，获得好的经济价值及生态意义。

1 材料与方法

1.1 材料与灭菌及培养条件

将采自大连郊区山坡上的平车前植株用清水冲洗干净后，根和叶柄剪成5 cm左右的段状，叶片剪成若干5 cm左右的小块状后，放到磨口广口瓶中，用自来水振荡洗涤10 min，之后用体积分数为0.05%安利洗涤液洗涤约10 min，再用自来水振荡洗涤3～5次至材料无泡沫。将材料置于超净工作台上，用体积分数为70%～75%的乙醇灭菌12s左右后，迅速用无菌水振荡洗涤3～5次，再加入浓度为0.05%的HgCl2溶液浸泡灭菌14 min，紧接着用无菌水洗涤4～5次即获得无菌材料。MS培养基中蔗糖含量为30 g·L－1，1/2MS 培养基中蔗糖含量为 15 g·L－1，琼脂含量为 4.5 g·L－1，pH 5.8 ～6.0，每日持续光照12 h，光照强度为2 000Lx，培养温度为24℃。

1.2 方法

1.2.1 不同生长素对根、叶片和叶柄愈伤组织诱导的影响

将无菌材料中的根和叶柄剪成长0.5 cm左右的小段，叶片剪成边长为0.5 cm左右的小块。剪取材料时，尽可能取幼嫩部位。将以上3种材料分别接种于添加不同生长素的MS培养基上进行愈伤组织的诱导培养，材料先置于暗箱中培养15 d，再置于恒温光照培养箱中培养30 d。每种培养基每种材料接种培养30个。

1.2.2 不同浓度配比的6－BA和2，4－D对平车前叶柄愈伤组织诱导的影响

将无菌的平车前叶柄剪成0.5 cm左右的小段，接种到附加不同浓度6－BA和2，4－D的MS培养基上进行愈伤组织的诱导培养，每种培养基接种培养40个材料，先置于暗箱中培养15 d，再置于光照培养箱中培养30 d。试验重复3次。观察平车前叶柄的出愈情况，45 d后统计结果。

1.2.3 不同浓度6－BA、2，4－D 和 NAA 配比对愈伤组织增殖的影响

将在 MS+6－BA0.2mg/L+2，4－D2.0 mg/L+蔗糖30 g/L培养基上初代培养的愈伤组织分成0.4～0.5 cm左右的块状后，接种在附加不同浓度6－BA、2，4－D和NAA配比的增殖培养基上，置于恒温光照培养箱中进行平车前愈伤组织的增殖培养。每种培养基接种50个材料，每种处理重复3次。观察愈伤组织的生长情况，45 d后统计愈伤组织的增殖状况。

1.2.4 不同浓度6－BA、KT和NAA对愈伤组织分化的影响

以MS为基本培养基、附加不同浓度的6－BA、KT和NAA，设计出12种培养基，将 MS+6－BA0.2 mg/L+NAA2.0mg/L+蔗糖30 g/L这一培养基上继代培养后颜色嫩绿的愈伤组织接种到各种培养基中，每种培养基接种100个直径约为0.5cm的愈伤组织团块，置于恒温光照培养箱中进行为期45 d的愈伤组织分化培养并统计分化率，此试验重复2次。把分化培养的平车前不定芽从基部剪下，接种到与颗粒状愈伤组织分化培养相同的培养基上，进行不定芽的分化继代培养。

1.2.5 不同生长素对平车前不定芽生根的影响

将上述继代分化培养的不定芽从基部剪下，接种到以1/2MS为基本培养基，分别附加 IAA 0.2 mg/L、IBA 0.2 mg/L、NAA 0.2 mg/L、2，4 － D 0.2 mg/L 和蔗糖 15 g/L 的培养基上。接种时不定芽植物学下部的生长点插入培养基，于变温光照条件下进行生根培养。每种培养基接种培养45个材料，试验重复2次。

1.2.6 炼苗移栽

将培养着生长旺盛，根系发达试管苗的培养瓶打开瓶塞，将试管苗转移到有水的烧杯中，置于阳光不能直射的实验台上，炼苗3d后移栽到上半层分别为干净河沙、炉灰渣和园土，下半层为肥沃园土的温室花盆中，移栽试验重复2次，共移栽300株。

2 结果

2.1 不同生长素对根、叶片和叶柄愈伤组织诱导的影响

外植体接种10 d后，叶片边缘及叶柄、根两端切口出现膨大，已形成白色的愈伤组织;暗箱中培养15 d后，转到光照培养箱中培养，在以2，4－D为生长素的培养基上愈伤组织颜色慢慢转为嫩黄色(见图1)。45 d后统计，结果见表1。由表可见以叶柄为外植体愈伤组织诱导率优于叶片和根，叶片的诱导率要高于根。单独使用2，4－D的诱导效果最好，NAA次之，单独使用IBA和IAA两种生长素几乎不能诱导这三种平车前材料形成愈伤组织。随着诱导时间的延长，含有NAA的培养基愈伤组织会分化成根。试验结果表明，叶柄是平车前愈伤组织诱导的最佳外植体，2，4－D是平车前愈伤组织诱导的最佳生长素。

图1 诱导的平车前愈伤组织Fig.1 The induction of callus

表1 不同生长素对不同材料愈伤组织诱导的影响Tab.1 The effects of different auxin on callus induction of different explants

2.2 不同浓度配比的6－BA和2，4－D对平车前叶柄愈伤组织诱导的影响

由表2可见，接种培养的平车前叶柄在所有培养基中都能诱导形成愈伤组织，每种培养基的诱导率都达到了100%。但从愈伤组织的生长速度和愈伤组织的长势看，4号培养基诱导形成的愈伤组织生长速度快、长势好。接种在这种培养基上的叶柄，培养10d左右外植体两端切口开始出现愈伤组织，随后愈伤组织开始迅速生长。初期形成的愈伤组织外表光滑、浅黄色的半透明状，培养到45d变成直径为0.2cm左右黄绿色颗粒状。观察还表明，当2，4－D浓度过高时，抑制愈伤组织生长。6、7号培养基出现水浸状愈伤组织，可能与其生长素浓度较高有关。因此，MS+6－BA0.2mg/L+2，4－D2.0 mg/L+蔗糖30 g/L 是愈伤组织诱导的最佳培养基。注:+++为长势好，++为长势较好，+为长势一般。

表2 不同植物生长调节剂配比对叶柄愈伤组织诱导的影响Tab.2 The effects of different hormone combinations on callus induction of stripes

2.3 不同浓度6－BA、2，4－D和NAA配比对愈伤组织增殖的影响

接种10 d后可见愈伤组织开始慢慢增大。由表3可看出，试验所用的培养基均能够不同程度的使愈伤组织增殖。观察结果表明，虽然2，4－D是诱导平车前愈伤组织的最佳生长素，但却不适合愈伤组织继代培养。在3号培养基即附加了浓度为0.2 mg/L 6－BA和浓度为2.0 mg/L NAA、基本培养基为MS的培养基上，愈伤组织的增殖速度最快，所培养出的颗粒状愈伤组织质地疏松，并呈有光泽的嫩绿色(见图2)，生长速度较快，试验证明此种愈伤组织具有分化能力。把在3号培养基上培养45d的愈伤组织，在相同培养基上进行继代培养，连续培养3代，所形成的愈伤组织的外观仍然保持不变。以上试验表明，MS+6－BA0.2 mg/L+NAA2.0 mg/L是平车前愈伤组织增殖的理想培养基。

图2 愈伤组织的增殖培养Fig.2 The proliferation of callus

表3 不同生长调节剂配比对愈伤组织增殖的影响Tab.3 The effects of different hormone combination on callus proliferation

2.4 不同浓度6－BA、KT和NAA对愈伤组织分化的影响

由表4可以看出，在不加激素、只单加6－BA、KT两种细胞分裂素的培养基中平车前颗粒状愈伤组织均不能分化，而在不同浓度配比的6－BA和NAA，KT和NAA的培养基中，平车前的颗粒状愈伤组织会不同程度地分化出根(见图3)。由此也可以看出，平车前愈伤组织可能含有较多的内源生长素。但添加三种激素的培养基中，愈伤组织分化出了不定芽。在添加6－BA 1.0 mg/L、KT1.0 mg/L和NAA0.5 mg/L的培养基上，分化培养到14d左右时，愈伤组织颗粒即可分化出可见芽点。分化培养到45d时，不仅颗粒状愈伤组织的分化率达到了87%，每个愈伤组织颗粒还会分化形成为有3～7个不定芽组成的长势较好丛生不定芽。但在光照不强的情况下，愈伤组织会因为花青素较多而变成紫红色(见图4)。把上述分化培养形成的丛生不定芽从基部剪下，接种到相同的培养基上进行不定芽的分化培养。经过3次重复试验证明，不定芽经过45d培养，平均每个培养的不定芽可分化生长出高5 cm以上的不定芽5.7个。以上试验表明，MS+6 － BA1.0 mg/L+KT1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+蔗糖30 g/L是愈伤组织分化的最佳培养基。

图3 分化出根的愈伤组织Fig.3 Differentiation out of the root of callus

图4 分化后出现花青素的愈伤组织Fig.4 Anthocyanins in callus

表4 不同浓度6－BA、KT和NAA对愈伤组织分化的影响Tab.4 The effects of different hormone combination on callus differentiation

2.5 不同生长素对平车前不定芽生根的影响

28 d观察统计，结果见表5。在添加IAA培养基上生根率为100%且试管苗长势最好。观察发现，在添加IAA培养基上，不定芽培养至第8 d开始生根，从平均生根数、根长以及苗长势等方面看，变温条件下有利于平车前生长芽生根的生长素依次为IAA、NAA、IBA和2，4－ D。因此，IAA是平车前生长芽生根的最佳生长素。

表5 生长芽变温光照下生根情况Tab.5 The rooting situation of Plantago depressa with poikilothermal illumination

2.6 移栽

移栽后30 d统计证明:移栽的理想基质为园土，移栽成活300株，成活率为100%。

定植后30 d统计证明:定植成活 100株，成活率100%。定植成活的试管苗生长良好，当年开花结果，保持了野生平车前的植物学性状(见图5)。

图5 移栽的试管苗Fig.5 Tube seedlings of transplanting

3 讨论

对于愈伤组织的诱导，取材部位［13］，生理状态及外植体大小都会影响培养结果。在植物的组织培养中用于愈伤组织诱导的外植体一般取自幼嫩部位或新生长的器官组织，如幼嫩的叶片、根、花、茎段、块根和块茎等。本次研究发现，叶柄是平车前愈伤组织诱导的最佳外植体，根和叶片不适合愈伤组织诱导。将培养材料置于暗培养条件下，培养7d后取出进行光照培养，这样操作更有利于愈伤组织的诱导［14］。平车前愈伤组织的诱导也需要进行暗培养，直接进行光照培养会引起外植体的死亡。诱导愈伤组织，2，4－D的生长调节活性最强，NAA次之，IAA和IBA的作用较弱较差［15］。本次研究证明，平车前愈伤组织的诱导的最佳生长素是 2，4 －D。MS+6－BA0.2 mg/L+2，4－D2.0 mg/L+蔗糖30 g/L是平车前叶柄愈伤组织诱导的最佳培养基，MS+6 －BA0.2 mg/L+NAA2.0 mg/L+蔗糖30 g/L是平车前愈伤组织继代增殖培养的最佳培养基。在愈伤组织分化培养的过程中，最好是先诱导分化出芽，因为形成芽后在其基部很容易形成根。但愈伤组织先分化形成根则会抑制芽的形成［16］。生长素/细胞分裂素比例决定着芽和根的分化。一般来说，当生长素比细胞分裂素比值高时，有利于根的生长，比值低时有利于芽的生长，中间比值利于愈伤组织的诱导和分化［17－18］。本次研究发现，在不同浓度配比的6－BA和NAA，KT和NAA的培养基中，平车前的颗粒状愈伤组织会不同程度地分化出根。只有在添加6－BA、NAA和KT三种激素的培养基中，平车前愈伤组织分化出了不定芽，分化的最佳培养基为MS+6－BA1.0 mg/L+KT1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+蔗糖30 g/L。分化培养的愈伤组织需要充足的光照，在试验过程中，由于光照不足有的愈伤组织会因为细胞含有较多的花青素而呈现紫红色。

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