不同碱裂解法快速提取甜菜大群体DNA的研究

吴则东 ，王华忠 ，倪洪涛

（1.黑龙江省普通高等学校甜菜遗传育种重点实验室/黑龙江大学，哈尔滨150080；2.中国农业科学院甜菜研究所/黑龙江大学农作物研究院，哈尔滨150080；3.中国农业科学院北方糖料作物资源与利用重点开放实验室，哈尔滨150080；4.黑龙江大学资源与环境学院，哈尔滨 150080）

近些年来，分子生物学发展较快，分子生物学技术也已经广泛地应用到作物的多个领域，例如种子纯度的鉴定[1]、构建指纹图谱[2－3]、遗传多样性分析[4]、遗传图谱的构建[5－6]以及植物数量性状位点的定位[5]等等，但这一切都有赖于植物基因组DNA的提取。从目前的发展来看，植物基因组DNA的提取主要有SDS法和CTAB法，虽然还有一些试剂盒可以直接用于植物DNA的提取，但是这些方法一般都是步骤较多，要用到很多药品，提取过程相对复杂，而且还要用到一些有毒的试剂。而甜菜作为世界两大糖料作物之一，这些年来分子生物学方面也得到了很大的发展，目前文献报道的甜菜基因组DNA提取主要是利用SDS以及CTAB对甜菜叶片进行提取，而利用碱裂解法对甜菜大群体进行基因组DNA的提取还没有相关的报道，目前见诸文献应用此种方法提取基因组DNA主要是玉米[7-10]、高粱[11]、水稻[12]等作物。本实验尝试利用NaOH对甜菜干种子进行DNA的提取，旨在建立一种快速提取甜菜大群体DNA的方法，为将来快速鉴定甜菜品种纯度以及真实性打下基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

供试材料为黑龙江大学农作物研究院遗传改良重点实验室提供的4个甜菜品系，分别是二倍体遗传单胚细胞质雄性不育系JV7，JV9和JV11，以及1个四倍体品系TB401。

1.2 试剂及仪器

1.2.1 实验中所用的试剂 0.5M的NaOH（现用现配）；琼脂糖；上样缓冲液：0.125%的溴酚蓝，0.125%的二甲苯青FF，40%的蔗糖；无水乙醇；丙烯酰胺；甲叉双丙烯酰胺；硝酸银；NaOH；甲醛。

1.2.2 实验中所用的仪器 伯乐电泳仪；JY-SPAT型水平电泳槽；北京六一的DYCZ-30型电泳槽；离心机。

1.3 DNA的提取

采用张明永及郭景伦等人[7，10，13]的方法，略加改动，采用4种方法进行甜菜干种子DNA的提取，每种方法均取每个样品的1～3粒干种子（单胚种子3粒，多胚四倍体种子1粒），大约30mg，不同方法前处理不同。①利用100μL 0.5M的NaOH对胚进行研磨，研磨后倒入1.5mL的离心管中，10000r/min离心5min，取出上清液，用100μL无水乙醇洗涤，倒掉上清液，待乙醇挥发后，加入100μL TE缓冲液，-20℃保存；②利用100μL 0.5M的NaOH对种子直接进行研磨，其它与①相同；③先将干种子的胚取出，打碎后，放入1.5mL的离心管中，再加入100μL 0.5M的NaOH，上下颠倒使NaOH溶液充分浸入到甜菜胚的粉末中去，然后再沸水浴5min，冷却至室温后，10000r/min离心5min，取出上清液，用100μL无水乙醇洗涤，倒掉上清液，待乙醇挥发后，加入100μL TE缓冲液，4℃保存；④将种子直接研磨成粉末，放入1.5mL的离心管中，再加入100μL 0.5M的NaOH，其余步骤与③相同。

1.4 DNA质量与数量的检测

取5μL DNA样品与1μL上样缓冲液，利用离心机将其混匀，利用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性（电泳缓冲液为0.5×TBE）。同时，加入已知浓度的Lambda DNA，估算DNA样品的浓度。

1.5 SSR反应

⑴SSR引物：本实验中所用的SSR引物来源于文献[14-17]，引物由上海生工生物工程公司合成。

⑵SSR反应体系：将提取的DNA稀释到10ng/μL，在20μL反应体系中包括模板DNA 4μL，2×Taq PCR master mix 10μL，正反向引物各60ng，其余用无菌双蒸水补充。

⑶SSR反应程序：扩增反应在PTC-100上进行，反应程序为：94℃预变性3min，1个循环；94℃变性50s，52℃退火 50s，72℃延伸 50s，32个循环；72℃延伸 10min，最后 4℃保存。

2 结果与分析

2.1 DNA的检测及纯度鉴定

从干种子中提取的DNA利用0.8%的琼脂糖进行检测，同时利用Lambda DNA进行定量分析，结果见图1。从图1可以看出，4种方法均从甜菜干种子提取出了DNA，DNA的完整性都很好，而且RNA含量较低；从提取的DNA含量来看，利用NaOH直接研磨胚及种子提取的DNA含量相差不大，从提取的DNA与Lambda DNA对比结果来看，利用碱直接研磨不经水沸每30mg干种子大约提取DNA 600ng；对种子和胚研磨后加NaOH再水沸的结果见图中后两组，从图中我们可以看出，干种子直接研磨处理效果非常好，从与Lambda DNA对比结果来看，每30mg干种子提取DNA超过 1μg；而胚研磨水沸的效果则比较差，是4种方法中提取DNA最少的一种，含量较低。

图1 4种方法提取DNA琼脂糖检测结果

2.2 SSR结果分析

利用提取DNA量最多的第四种方法获得的DNA对前3个单胚样品进行SSR-PCR分析，并利用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行检测，银染结果见图2。从图2我们可以看出，利用NaOH提取的甜菜干种子DNA，虽然减少了很多常规提取DNA的环节，里面有些杂质也没有完全去除干净，但依然能够扩增出清晰的条带，完全能够满足SSR扩增的需要。

图2 8%聚丙烯酰胺凝胶银染图

3 讨论

本实验利用碱裂解法首次从甜菜干种子中提取到了DNA，通过不同提取方法的对比，确立了先对种子进行研磨，然后再加NaOH溶液，沸水处理5min为最佳提取甜菜大群体DNA的方法。本方法仅使用2～3粒甜菜单胚种子就可以在10几分钟的时间内提取到超过1μg的DNA，而且提取的DNA完整性好，RNA含量极低，能很好地应用于SSR反应，因为应用本方法不需要使用液氮以及有毒的氯仿、苯酚等等，由于是直接使用干种子进行DNA的提取，所以也省去了种子发芽或者利用真空冷冻干燥机[18]对叶片的处理，另外由于甜菜种子研磨比较容易，所以不需要使用粉碎机[19]或者电钻[20]进行种子的粉碎，实验方法大大的简化。将来随着甜菜分子指纹图谱的建立，一个普通的分子实验室完全可以在一天内仅仅利用甜菜种子就可以对上百份样品完成品种的纯度及真伪的鉴定。本方法由于其简单、易操作、步骤少等优点能够更好地促进甜菜分子生物学向实用性上快速发展。

[1]卢锐，叶永亮，冯国军.EST-SSR 标记在黄瓜 F1种子纯度鉴定中的应用[J].北方园艺，2010（18）：136-138.

[2]胡景涛，黄文章，严明建，等.十二份三系杂交稻亲本的指纹图谱构建与应用[J].湖北农业科学，2011，50（10）：2122-2124.

[3]刘逢举，王冰，杨付新.中棉所系列棉花杂交种12个亲本的SSR指纹图谱构建与应用[A].中国棉花学会2012年年会暨第八次代表大会[C].山西运城，2012： 58-61.

[4]王茂芊，吴则东，王华忠.利用 SRAP标记分析我国甜菜三大产区骨干材料的遗传多样性[J].作物学报，2011，37（5）：811-819.

[5]Grimmer M，Trybush S，Hanley S，et al.An anchored linkage map for sugar beet based on AFLPSNPandRAPDmarkersandQTLmapping of a new source of resistance to beet necrotic yellow vein virus[J].TAG Theoretical and Applied Genetics，2007，114（7）：1151-1160.

[6]Rae S，Aldam C，Dominguez I，et al.Development and incorporation of microsatellite markers into the linkage map of sugar beet（Beta vulgaris spp.）[J].TAG Theoretical and Applied Genetic，2000，100（8）：1240-1248.

[7]郭景伦，赵久然，尉德铭，等.玉米单粒种子 DNA 提取新方法[J].北京农业科学，1997（2）：2-3.

[8]谭君，杨俊品.玉米种子DNA快速提取及杂交种纯度的快速鉴定[J].分子植物育种，2009，7（4）：811-816.

[9]闫米格，许晶，骈跃斌，等.玉米种子纯度鉴定中 DNA 提取方法的比较研究[J].山东农业科学，2011（9）：7-8，14.

[10]郭景伦，赵久然，王凤格.适用于SSR分子标记的玉米单粒种子DNA快速提取新方法[J].玉米科学，2005（2）：16-17，25.

[11]郑卓，李健，圣忠华，等.高粱总 DNA 不同提取方法的比较[J].安徽农业科学，2008，35（36）：11758-11759.

[12]田洁，罗科.水稻总 DNA 的快速制备[J].应用与环境生物学报，2004，10（2）：143-145.

[13]张明永，孙彩云，梁承邺.一步法提取植物 DNA 用于大规模 RAPD 分析[J].遗传，2000（2）：106.

[14]Cureton A，Burns M，Ford‐Lloyd B，et al.Development of simple sequence repeat（SSR） markers for the assessment of gene flow between sea beet（Beta vulgaris ssp.maritima） populations[J].Molecular Ecology Notes，2002，2（4）：402-403.

[15]Smulders MJ，Esselink GD，Everaert I，et al.Characterisation of sugar beet（Beta vulgaris L.ssp.vulgaris） varieties using microsatellite markers[J].BMC genetics，2010，11：41.

[16]Laurent V，Devaux P，Thiel T，et al.Comparative effectiveness of sugar beet microsatellite markers isolated from genomic libraries and GenBank ESTs to map the sugar beet genome[J].TAG Theoretical and applied genetics Theoretische und angewandte Genetik，2007，115（6）：793-805.

[17]Richards CM，Brownson M，Mitchell SE，et al.Polymorphic microsatellite markers for inferring diversity in wild and domesticated sugar beet（Beta vulgaris）[J].Molecular Ecology Notes，2004，4（2）：243-245.

[18]靖相密，褚云霞，汤庚国，等.不同保存方法对蜡梅总DNA提取效果的影响及ISSR-PCR验证[J].分子植物育种，2008，6（2）：387-392.

[19]赵艳丽，刘国琴.一种快速提取小麦 DNA 的方法[J].郑州工程学院学报，2002，23（3）：62-65.

[20]高玉峰，张攀，郝晓敏，等.一种快速提取玉米大群体基因组DNA的方法[J].中国农业大学学报，2011，16（6）：32-36.