重组exendin-4类似物EW的制备及其体内降糖活性分析

吴晓琰 施小梅 陆怡

(复旦大学附属华山医院老年科，上海 200040)

理想的抗糖尿病药物应能长期控制血糖，维持胰腺β细胞体积并防止其功能减退，保护正常的进食生理反应。胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是小肠黏膜分泌的多肽，进食后浓度迅速增高，半衰期 1.5 ～2.1 min［1］。GLP-1 对 2 型糖尿病的多重作用包括血糖依赖性刺激胰岛素分泌、增加胰腺β细胞体积及功能、抑制胰高血糖素分泌及食欲。GLP-1由血浆中的二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase-4，DPP4)酶解，由肾脏及其他蛋白酶如人中性内肽酶24.11(neutral endopeptidase 24.11，NEP24.11)清除，前者为主要途径。GLP-1受体途径治疗是目前糖尿病治疗的新的里程碑［2-3］，包括GLP-1受体激动剂及DPP4酶抑制剂。GLP-1受体激动剂exendin-4含39个氨基酸，与GLP-1受体结合并激活受体，模拟GLP-1的功能。exendin-4肽链:HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEW LKNGG PSSGA PPPS(NH2)，其N端的序列为His、Gly，能够抵抗DPP4，半衰期3～5 h，化学合成的exendin-4于2005年被 FDA批准。研究［4-5］证明 exendin-4具有良好的降糖作用，且安全性高，可以单独应用或与其他口服抗糖尿病药物联用。exendin-4还可使患者体质量持续减轻，并使多项心血管危险因素如胰岛β细胞功能稳态模型评估(homeostasis model assessment for beta cell function，HOMA-B)、血压、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)下降，使保护因素高密度脂蛋白(HDL)升高，并且使基线时升高的丙氨酸氨基转移酶(ALT)及天门冬氨酸氨基转移酶(AST)恢复正常，不良反应少，耐受良好［6］。然而exendin-4较 GLP-1多9个氨基酸，有免疫源性，40% ～50%患者血浆中检测到不同滴度的抗体［7］。

根据既往研究，本研究设计了exendin-4类似物EW(PCT/CN2009/001321，exendin-4 的类似物)，肽链长度32个氨基酸。其C末端为OH，长度及氨基酸组成与母体GLP-1相近，N端的3个氨基酸为His、Gly、Glu。与 exendin-4 相同，EW 能抵抗 DPP4的酶解，在体内具有与exendin-4相似的降糖活性，其结构适合基因工程制备。EW肽链:HGEGT YTSDL SSQME EEAVK LFIEW LLNGG PR(OH)。

1 资料与方法

1.1 材料 C57BL/6小鼠(购自上海中国科学院实验动物中心)，大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)JM109 DH5α，质粒 pUC18，限制性内切酶(EcoRⅠ、BglⅡ、BamHⅠ及 SalⅠ)，T4 DNA 连接酶，Taq 酶，高保真酶PrimerSTARTM HS DNA Polymerase等(美国Invitrogen公司生产)。exendin-4(美国Lilly公司生产)。测试及制备 HPLC(美国 Agilent公司生产)。飞行质谱MALDI-MS(LCQ Deka XP Plus，美国Thermo公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 基因工程菌 E.coli保存方法 0.4 mL的100%甘油中加入0.6 mL的log中期的非诱导菌长至饱和的培养基中，充分搅匀，置于-70℃冰箱中保存。

1.2.2 构建EW基因 EW的多肽序列如上，EW基因C-末端设计为E.coli的终止密码;寡核苷酸设计中含EcoRⅠ、BglⅡ、BamHⅠ、SalⅠ位点和氨基端的一个胰蛋白酶酶切位点Arg。采用以下5个引物，在PCR仪上进行扩增:引物1(5’-AATTCCAGATCTCGTCACGGCGAAGGCACCTACA-3’);引物 2(5’-CTGGCTGCTCAGATCGCTGGTGTAGGTGCCTTCG-CCGTGACGAGATCTGG-3’);引物 3( 5 ’-CCAGCGATCTGGCAGCCAGATGGAAGAAGAAGC-GGTTAA-3’);引 物 4(5’-CCAGCCATCAGAACAGTTTAACCGCTTCTTCTTCCAT-3’);引 物 5(5’-ACTGTTCATCGATGGTGTTAACGGCGGCCCGCGTGGATCCT-AG-3’)。

1.2.3 构建含8个拷贝EW的基因序列及感受态E.coli表达菌株 将pUC18质粒和合成的DNA用EcoRⅠ及SalⅠ酶切，连接并转入E.Coli DH5α中。阳性重组质粒用PCR的方法验证。证实的重组质粒用BamHⅠ及SalⅠ进行酶切;同时，合成的DNA用BglⅡ及SalⅠ进行酶切;连接并转入pUC18质粒中。从而得到具有2个拷贝的EW基因的阳性重组质粒。不断重复，直至重组pUC18质粒中包含8个拷贝EW的基因序列。将pUC18+8EW阳性质粒转入E.Coli JM 109菌种，经鉴定为阳性克隆者，作为菌种保存。

1.2.4 细菌发酵 在LB培养基(pH 7.0)300 mL中加入转化体基因工程菌200 μL、25 mg/mL的氨苄西林700 μL、1 mL的50%的甘油以及20%硫酸镁300 μL，恒温振荡器中 200 r/min(37 ℃)，使基因工程菌 E.coli生长，当细菌生长至 OD600=0.9时加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导8 h，取出锥形瓶，4℃ 5000 r/min离心45 min，除去上清液，收集E.coli菌体沉淀。-70℃冰箱保存。

1.2.5 融合蛋白电泳 采用分离胶浓度为12%的SDS-PAGE进行蛋白电泳。发酵液未加IPTG诱导、发酵液加IPTG诱导后8 h以及发酵液加IPTG诱导后12 h，各取1 mL发酵液置于塑料EP离心管中，8000 r/min离心5 min，除去上清液，溶解样品，细菌裂解物加入1 mL SDS-PAGE样品缓冲液，煮沸3 min，加入少量尿素晶体增溶，加样20 μL，进行蛋白电泳。按分子量标志物、未诱导、诱导8 h、诱导12 h的顺序加样，电泳。

1.2.6 纯化融合蛋白 沉淀悬浮于8 mol/L尿素溶液，用匀浆器15000 r/min打匀。溶液4℃15000 r/min离心30 min，上清中含可溶性包涵体。然后将上清液按1∶25稀释，逐滴加入复性缓冲液［1 mol/L Tris-HCl(pH 7.3)，0.25 mol/L 蔗糖，2 mmol/L EDTA］，持续搅拌，20℃保存24 h。再经过15000 r/min(4℃)离心30 min后取沉淀。加入2 mol/L尿素溶液，洗涤，10000 r/min离心30 min后取沉淀，重复3次。将沉淀真空冷冻干燥。

1.2.7 融合蛋白的酶切及制备 将300 mg包涵体加入双蒸馏水200 mL，电磁搅拌，逐滴加入二羧酸，用碳酸氢钠调节pH值保持7.0，将融合蛋白溶于水，透析，pH 7.5，加入高纯度的胰蛋白酶5 mg及5 μL 20%氯化钙溶液，2 mol/L盐酸溶液1 mL。30℃ 5 h，持续电磁搅拌。逐滴加入2 mol/L盐酸溶液，至pH值3，室温过夜，4℃ 10000 r/min离心30 min，取沉淀。制备反相高效液相色谱(reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC)1100 series(美国 Agilent公司)，C18柱(φ30×300 mm)。线性梯度20% ～80%乙腈，含0.1%三氟乙酸，30 mL/min，30 min一个周期。220 nm的每个峰均进行小肽蛋白电泳分析。将沉淀溶于水，每次进样量为5 mL。制备HPLC显示，24.4 min峰为目标峰。收集目标峰。真空负压冷冻干燥，-70℃储存。

1.2.8 C57BL/6小鼠的降糖作用 实验遵循“北京医科大学动物照料及福利委员会”准则。C57BL/6小鼠(雄性，8周，体质量约20 g)饲养在恒温［(22±2)℃］、12 h照明/12 h黑暗的环境中。饮水及标准啮齿类动物饮食供应。18 h禁食后，毛细管取10 μL尾静脉血，转入肝素化微量离心管中，离心后将血浆保存于-20℃、待血糖测定。血浆葡萄糖测定采用葡萄糖氧化酶法。随机分为3组，每组10只，组间体质量差异无统计学意义(P＞0.05)，3组小鼠取空腹血后分别腹腔注射 EW(2 μg EW/100 μL 0.9%氯化钠溶液)、exendin-4(2 μg exendin-4/100 μL 0.9%氯化钠溶液)、0.9%氯化钠溶液(100 μL)之后，即刻及每隔2 h腹腔内注射20%葡萄糖300 μL，腹腔内注射葡萄糖共4次直至最初给糖后8 h。每次给葡萄糖后20 min取10 μL尾静脉血，测定血糖。

1.3 统计学处理 采用SPSS 10.0统计软件，计量资料以均值±标准差()表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 构建含8个拷贝EW的基因序列 pUC18质粒和合成的 DNA 用 EcoRⅠ、BglⅡ、BamHⅠ及 SalⅠ酶切，全序列见图1，8个基因串联的方法见图2。

图1 8个拷贝的EW基因的全序列

2.2 表达含8个拷贝EW基因的融合蛋白 少量转染E.coli，检测质粒能否有效表达。加样量20 μL，采用分离胶12%的SDS-PAGE进行蛋白电泳。见图3。转化后的E.coli中EW的表达量可达20%。

2.3 发酵 恒温振荡器中于200 r/min 37℃发酵，4℃ 5000 r/min离心45 min后除去上清液，收集沉淀为基因工程菌菌体。锥形摇瓶培养最终收率是200～250 mg湿细胞/L发酵液。

2.4 纯化融合蛋白、融合蛋白的酶切及制备HPLC显示，24.4 min峰为目标峰。目标峰真空负压冷冻干燥。目的多肽EW的制备HPLC图形见图4，1为目的峰。

2.5 EW的飞行质谱分析 冷冻干燥后白色粉末溶于双蒸水1 mg/mL，进样量10 μL，行MALDI-MS。目的多肽EW分子量为3581.5 Da。

2.6 血浆葡萄糖测定 注射前EW、exendin-4及对照组平均血糖分别为(6.39 ±1.37)mmol/L、(5.87±1.16)mmol/L 及(6.18 ± 1.15)mmol/L(P ＞ 0.05)。4次葡萄糖注射后，对照组平均血糖逐渐上升至(25.04 ±2.10)mmol/L，而 EW 及 exendin-4 治疗组平均血糖浓度分别是(8.54 ±2.10)mmol/L、(6.93±1.84)mmol/L，两组间差异无统计学意义，但治疗组与对照组间差异有统计学意义(P＜0.01)。

3 讨 论

化学合成的exendin-4价格高昂。我国华东理工大学在毕赤酵母中以融合蛋白的形式表达exendin-4，发酵需要120 h，融合蛋白以肠激酶切断纯化，目的 exendin-4收率低，约3.15 mg/10 g细菌。此外，肠激酶是昂贵的蛋白水解酶，不适合工业用［8］。我们的研究发现，32个氨基酸的类似物具有与exendin-4相同的生物活性(另文发表)。因此本研究将exendin-4缩短至32个氨基酸并更换部分氨基酸，设计了exendin-4类似物EW，将EW串联后在E.coli中表达，通过胰蛋白酶定点切断获得重组EW。胰蛋白酶切断肽链的位点在赖氨酸或精氨酸的羧基端。EW的序列中有1个赖氨酸及1个精氨酸。我们应用二羧酸可逆性与赖氨酸结合保护了赖氨酸的胰蛋白酶的酶切位点，在后续的酶切反应中，胰蛋白酶仅切断串联表达的融合蛋白EW8，酶切位点是每个精氨酸的羧基端。酶切后，调整pH值以除去二羧酸，从而获得8个重组EW。EW收率为70～80 mg/10 g细菌。这种胰蛋白酶酶切可以用于末端是精氨酸的肽链，但肽链中不含精氨酸的目的多肽，不论肽链中有无赖氨酸。精氨酸可以作为一种标签用于串联表达目的多肽。胰蛋白酶在二羧酸对赖氨酸保护后精氨酸羧基端的切断将会成为基因工程多肽合成时一种新的蛋白酶切的方法，这在既往多肽基因工程合成中从未被报告过。

重组EW在小鼠体内显示了良好的降糖活性。在我们的降糖作用评估中，仅1次给 EW及exendin-4，每隔2 h给予糖负荷，降糖作用保持6 h以上。这表明exendin-4的C-端的7个氨基酸对于exendin-4体内的生物活性并非必须。

初步研究发现，EW这一exendin-4类似物是一个很有希望的抗糖尿病药物，它能通过基因工程大规模生产，值得进一步研究。

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