杆菌肽ELISA检测试剂盒的研制

刘宏军 ，冯才伟 ，王瑟如 ，韩京朋 ，丁小梅 ，钱宏光

（1.江苏省泰州市姜堰区动物卫生监督所，江苏泰州225500；2.北京勤邦生物技术有限公司，北京 102206）

杆菌肽，又称枯草菌肽，是由地衣芽孢杆菌或枯草杆菌变种的培养液分离而得[1]。对革兰氏阳性菌有较强的抑制作用，抗菌谱与青霉素G相似，被广泛用于治疗家禽、猪、牛等肠道、呼吸道、泌尿系统感染，作为兽药和饲料添加剂，具有抑菌、杀菌和明显的促生长作用，是目前国内外广泛用于饲料中的一种新型抗生素[2]。

杆菌肽属于多肽类抗生素，具有肾和神经毒性，其在动物组织中的残留会通过食物链传递给人类，其产生的毒副作用会对人体产生直接的危害，为此其安全问题已经日益引起人们的关注。我国农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中对杆菌肽药物最高残留限量（MRL）作出了规定：牛奶中杆菌肽最高残留限量为500μg/kg，在牛、猪、禽的可食用组织中为500μg/kg[3]。

目前，国外对于动物性食品中杆菌肽药物残留检测方法的报道为微生物法、薄层色谱法、免疫学法、毛细管电游泳法、高效液相色谱法等，国内报道的方法主要是微生物法，但其操作繁琐、灵敏度低、重现性差[4]。以免疫学检测技术为基础，建立起来的酶联免疫检测试剂盒可为建立监控动物性食品中杆菌肽残留提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料和试剂

甲醇（分析纯）、浓硫酸（分析纯）、1，5-戊二醛、正己烷（分析纯）、NaBH4、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)等生化试剂上海华美公司；96孔微孔测定板、杆菌肽标准品sigma公司。

1.1.2 仪器

酶标仪MK3、微量移液器美国Thermo；氮吹仪KL512美国Organomation；低速离心机AnkeTDL-40B上海安亭科学仪器；电子天平2000SBL美国Setra；8010S匀浆机上海斯伯明仪器设备有限公司；生化培养箱DHP-600天津市中环实验电炉；QL-901漩涡混合器海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液系统

各溶液参考王玉平方法配制[5]。

1.2.2 杆菌肽抗原的合成

取杆菌肽4 5mg，用1.5mL水溶解；取5 0%的1，5-戊二醛（GA）10μL加入杆菌肽溶解液中，室温下搅拌反应18h；称取载体蛋白（BSA或OVA）60mg用1.5 m L水稀释后加入杆菌肽溶解液中，反应24小时；加入24mgNaBH4反应3h；用三蒸水透析48小时，以除去未反应的小分子物质；分装，于-20℃保存备用。以杆菌肽-B S A作为免疫抗原，杆菌肽-O V A作为包被抗原。

1.2.3 抗体制备

参照沈泓方法并加以改进，制备抗杆菌肽单克隆抗体（McAb），测定效价，并冻存备用[6]。

1.2.4 微孔板包被

用0.01mol/LpH7.2的PBS将杆菌肽-OVA稀释到适当浓度，按100μL/孔加入酶标板微孔中，置于37℃恒温箱温育2h，甩干余液并洗涤一次；加入封闭液150μL/孔，置于37℃恒温箱温育2 h，甩干余液后拍干，置于铝箔袋中，抽真空干燥并密封，保存于4℃冰箱。

1.2.5 ELISA方法建立

配制质量浓度分别为 0、1.0、3.0、9.0、27.0、81.0μg/L的杆菌肽标准液，将上述制备的抗杆菌肽McAb与酶标二抗混合并混匀，预先平衡30min，配制为抗体-酶标二抗工作液。参照Tijssen方法进行竞争E LISA检测，检测步骤如下：向包被有杆菌肽-OVA的酶标板微孔中加入杆菌肽标准品或样品处理液50μL/孔，然后加入抗体-酶标二抗工作液50μL/孔，轻轻振荡混匀，置于25℃恒温箱中避光反应30min。甩干余液，洗涤5次后拍干，加入底物A液、B液各50μL/孔，避光反应15min后用50μL/孔的终止液终止，并用酶标仪检测各孔吸光度值(Optical density，OD)。

1.2.6 标准曲线绘制

以各标准品的O D450nm值除以0浓度标准品的O D450nm值再乘以1 0 0，得出吸光百分比[(B/B0%)]。以B/B0%值为纵坐标，各标准品浓度的常用对数值(l o g10[C])为横坐标绘制对应杆菌肽浓度的半对数坐标曲线图。从标准曲线中查出B/B0%为5 0%时对应的杆菌肽浓度即为I C50值。

1.2.7 样品前处理

1.2.7.1 动物组织样品

用均质器将动物组织样品均质；称取1.0±0.05g组织样品至50mL离心管中，加入10mL甲醇，用涡旋仪涡动3min，以3000r/min的转速，在室温（20～25℃）环境下离心5min；取1mL上层液体至10mL玻璃试管中，置于50～60℃水浴锅中用氮气流吹干；加入2mL复溶工作液，用涡旋仪涡动1min充分混匀；取5 0 μL用于分析。

1.2.7.2 牛奶样品

取1mL±0.05mL牛奶样品至2mL离心管中；加入30μL2M硫酸，再加入300μL甲醇，涡动30s，3000r/min的转速，在室温（20～25℃）环境下离心5min；避开上层悬浮物，吸取30μL上清液，加入570μL复溶工作液，用涡旋仪涡动2min使样品充分混匀；取50μL用于分析。

2 结果

2.1 ELISA工作曲线

图l为ELISA检测法工作曲线。曲线呈典型的S型，回归方程为：y=-2.0574x+1.0956，相关系数为0.9967，IC50为3.9μg/L，标准曲线中各标准品浓度对应的吸光百分比值的标准误差 (RSD)为1.8%～3.9%，结果表明杆菌肽在1.0～81.0μg/L范围具有良好线性。

2.2 基质干扰测试

分析P B S缓冲液、猪肉、猪肝、牛奶样品处理液4种基质对绘制标准曲线的影响，将杆菌肽分别溶于 4种基质中，配制成浓度为 0、1.0、3.0、9.0、27.0、81.0μg/L标准液，按照杆菌肽试剂盒的操作方法测定，绘制曲线进行分析。不同基质的杆菌肽标准品其OD450nm值不同，P B S缓冲液、猪肉、猪肝、牛奶处理液4种基质测定标准曲线的I C50分别为3.9μg/L、4.6μg/L、4.2μg/L、4.5 μg/L，表明尽管不同基质对标准品的OD450nm值有一定影响，但其IC50变化差异不大，对杆菌肽试剂盒的敏感性和检测结果影响不大，上述样品前处理方法是可行的。

2.3 杆菌肽试剂盒检测限

根据称取20份空白样品依据该试剂盒提供的检测方法进行测定，结果均值加3倍标准差，即为本试剂盒的检测下限。分别用竞争ELISA法检测20份阴性猪肉、猪肝、牛奶样品，测量每个样品OD450nm值，同时计算吸光百分比，代入标准曲线回归方程计算出每个样品所对应的log10[C]值，从而进一步计算出每个样品中杆菌肽含量。结果见表1，考虑到实际检测工作中的需要和操作方面的误差，确定试剂盒对猪肉、猪肝的检测限为20μg/kg；对牛奶的检测限为26μg/kg。

2.4 准确度和精密度测试

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准确度和精密度分别以回收率和变异系数表示。分别在阴性猪肉、猪肝、牛奶中添加不同浓度的杆菌肽标准品，每个浓度添加5份样品，共用3个批次试剂盒进行检测，计算样品回收率和变异系数，以评价试剂盒的准确度和精密度。

结果见表2，在猪肉、猪肝、牛奶样品中添加杆菌肽标准品回收率范围为70.2%～99.3%，批内变异系数范围为3.4%～13.0%，批间变异系数范围为7.9%～1 0.4%，批间变异系数小于对应的批内变异系数，且均未超过1 5%，表明杆菌肽试剂盒具有较高的准确度和精密度。

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2.5 稳定性试验结果

将杆菌肽试剂盒存放在37℃条件下，于不同时间制作标准曲线并作添加回收试验，依据标准曲线IC50值，各线性相关系数，0浓度的OD450nm值（B0）及添加回收率，判断杆菌肽试剂盒质量。

结果见表3，随着杆菌肽试剂盒保存时间的延长，R2、B0值和回收率持续减小，I C50持续增大，第9d时，IC50值和R2变化不大，B0值大于0.5，回收率大于60%，此时试剂盒仍可用于杆菌肽的检测，第11d时，试剂盒各项技术指标均出现大幅度下降，因此杆菌肽试剂盒在37℃可保存9d，相当于2～8℃可保存至少12个月。

3 讨论

随着国家对食品安全的逐步重视，ELISA在农药、兽药残留、生物毒素、毒品及真菌毒素等检测领域的应用越来越广泛，这就对ELISA的准确度和重复性提出了更高的要求，必须研究开发出能够经得起实际检验的ELISA试剂盒[7]。

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基质效应可能抑制免疫结合反应，使竞争效率下降，从而导致曲线异常，斜率减小，IC50增大，灵敏度下降[8]。本试验用杆菌肽试剂盒对PBS、猪肉、猪肝、牛奶样品4种基质所测标准曲线的IC50变化不大，说明不同样品处理液对杆菌肽试剂盒检测结果影响不大，样品的处理方法是可行的。

经调试，最终研制出用于检测动物组织和牛奶中杆菌肽的ELISA试剂盒，该杆菌肽试剂盒的线性工作范围为1.0～81.0μg/L，IC50为3.9μg/L，对猪肉、猪肝的检测限为20μg/kg，对牛奶的检测限为26μg/L；猪肉、猪肝、牛奶样品添加回收率范围为70.2%～99.3%，批内变异系数范围为3.4%～1 3.0%，批间变异系数范围为7.9%～10.4%，可在2～8℃条件下保存12个月。 □

[1] 任义广,曲志勇,王家春,等.液相色谱-质谱/质谱快速测定饲料中杆菌肽方法的研究[J].广东饲料,2010,(10):28～30.

[2] 周欣,李宝厍.杆菌肽的研究进展及应用[J].科技信息,2010,(14):92～93.

[3]农业部.动物性食品中兽药残留最高限量[J].中国兽药杂志,2003,37(4):15～20.

[4] 林维宣,孙兴权,田苗,等.动物组织中粘杆菌素,杆菌肽及维吉尼霉素残留量的液相色谱～串联质谱检测[J].分析测试学报,2009,28(2):212～215.

[5] 王玉平,计融,江涛,等.玉米赤霉烯酮ELISA定量检测试剂盒研制[J].卫生研究,2006,35(2):221～224.

[6] 沈泓,易喻,梅建凤,等.人绒促性素单克隆抗体的制备与分离纯化[J].Eur J Biochem.1999,265:627～637.

[7] 吴广枫.农产品质量安全及其检测技术[M].化学工业出版社农业科技出版中心,2007.

[8] 张海棠,王自良,刘玺,等.高亲和力克伦特罗单克隆抗体的研制及免疫试纸检测方法的建立[J].生物技术通报,2008,(5):149～153.