低氧对发育期幼鼠大脑皮层GAP-43表达的进行性影响

陈燕 张春来 余广 赵春玲

（泸州医学院生理教研室，四川 泸州 646000）

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（Obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）是儿童常见的睡眠问题，对儿童健康危害较大，在儿童中可引起多种并发症［1］。国外流行病学调查显示［2］，OSAHS在儿童中的发病率为1%～3%。儿童OSAHS与成人有很大差异，是一个独立的临床综合征。目前，对儿童OSAHS的研究远没有成人广泛，尚有很多问题需要解决。生长相关蛋白（GAP-43）是研究神经生长发育和损伤修复的重要标记物之一。目前，许多利用成年大鼠制作的各种脑损伤模型都观察到GAP-43表达的变化。然而，关于生长发育期幼鼠缺氧性脑损伤后，这一反映损伤后修复的重要指标有何变化，尚未见相关报道。因此，本实验选择21 日龄的幼鼠，通过模拟OSAHS 的典型病理生理特征，建立慢性间断性低氧（CIH）幼鼠模型，观察CIH 幼鼠在生长发育的不同时间点大脑皮层GAP-43表达的变化，以探讨这些变化与神经元损伤修复间的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康雄性21日龄Stragu-Dawley幼鼠60只，体质量50±5 g，由泸州医学院动物科提供（动物合格证号：SYXK（川）2004-065）。随机分为对照组和慢性间断性低氧组（CIH 组），每组30只，每组又分为2，4，6w3个时间点，每个时间点10只幼鼠。

1.2 方法

1.2.1 CIH 幼鼠模型复制

参照杨宇［3］等的方法制作CIH 幼鼠模型。将CIH 组幼鼠每日置于自制的缺氧舱内，舱内放入大量碱石灰和硅胶以吸收二氧化碳和水蒸气，舱壁留有小缝隙与舱外相通，使舱内气压与大气压平衡。实验期间，每天9∶00a.m.～5∶00p.m.向箱内循环充入氮气和排出混合空气，每次循环6min，通过HBO-2B型控氧仪（浙江建德梅城电化分析仪器厂）监测缺氧舱内的氧浓度以程控输气和排气装置，使每一次循环缺氧舱内最低氧浓度为8%，然后排除低氧气体同时吸入空气，使氧浓度逐渐恢复到21%。缺氧舱内二氧化碳浓度始终＜3%，温度保持22±2℃，连续缺氧直至取材。缺氧期间，大鼠摄食、饮水正常。对照组置于相同的缺氧舱内，通入空气，余处理同CIH 组。

1.2.2 标本制备

每组各时间点大鼠停止处理后，乙醚麻醉，用4%多聚甲醛灌注固定后取脑。在视交叉后缘、大脑脚与桥脑交界处把脑冠状切为3块，置于4%多聚甲醛中后固定4h以上，将固定好的脑组织进行常规脱水、二甲苯透明、石蜡包埋。

1.2.3 GAP-43免疫组织化学染色

石蜡连续切片，常规脱蜡至水，进行GAP-43 多克隆抗体的免疫组织化学标记，步骤如下：加入3%H2O2室温孵育10min，阻断内源性过氧化物酶；抗原微波修复；加入正常山羊血清37℃孵育30min，甩去多余液；滴加兔多克隆抗体GAP-43 50μL（1∶200），4 ℃过夜；滴加即用型二步法非生物素检测试剂盒中聚合物辅助剂50μL（1∶1）；滴加即用型二步法非生物素检测试剂盒中的试剂2；DAB显色5～10min，苏木精轻度复染，脱水、透明、封固。阴性对照用PBS液代替一抗，其余处理相同。

1.2.4 GAP-43半定量分析

GAP-43的标记强度用光密度（Optical density，OD）值表示。应用Nikon ECLIPSE 88i显微摄影系统及Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测定大鼠大脑皮层GAP-43的吸光度值。各组每一只大鼠脑切片的大脑皮层随机选取3个400×视野，分别测定其中阳性染色的OD 值，求其平均值，作为该大鼠大脑皮层的OD 值。同时，测定同一张切片上视束的吸光度值作为背景，GAP-43的吸光度值减去背景的吸光度值得到矫正吸光度值，即GAP-43免疫反应产物的实际吸光度值。用COD 值进行比较分析，以避免非特异性染色所造成的误差。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0统计学软件完成统计处理分析。实验数据采用表示，组内前后时间点的比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），组间对应时间点的比较采用t检验（Independent-samples t test），P＜0.05为差异具有显著性。

2 结果

GAP-43免疫反应阳性产物为棕黄色点状或颗粒状沉淀，主要分布于大脑皮层神经元胞浆中。组间对应时间点比较，CIH组各时间点GAP-43的COD 值均高于对照组，差异具有显著性（P＜0.05）。对照组内前后时间点比较，随着时间增加，GAP-43的COD值逐渐降低；与对照2周组比较，对照4周组和对照6周组GAP-43的COD值明显降低，差异具有显著性（P＜0.05）；而对照4周组与对照6周组比较，GAP-43的COD值差异无显著性（P＞0.05）。CIH 组内前后时间点比较，CIH6周组GAP-43的COD值较CIH2 周组和CIH4 周明显降低，差异具有显著性（P＜0.05）；而CIH2周组与CIH4周比较，GAP-43的COD 值差异无显著性（P＞0.05），见表1和图1。

表1 对照组和CIH 组各时间点大脑皮层GAP-43的COD 值（，n＝10）

表1 对照组和CIH 组各时间点大脑皮层GAP-43的COD 值（，n＝10）

注：与对照组对应时间点比较，aP＜0.05；与对照2 周组比较，b P＜0.05；与CIH6周组比较，cP＜0.05。

3 讨论

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（Obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）可发生在婴儿期至青春期任何年龄阶段的儿童，2～5 岁为发病高峰期［2］。大鼠出生后第20～22日龄是大鼠的断奶期，研究表明［4］，这与人类认知发育的幼儿期相当。一般将3月～12月龄大鼠称为成年大鼠，3月龄以前称为发育早期大鼠［5］。故本实验选择21日龄SD 幼鼠作为实验对象，将CIH 时间设定在幼鼠发育早期，从而观察CIH 对发育早期幼鼠大脑皮层GAP-43表达有何影响。

图1 对照组和CIH 组各时间点大脑皮层GAP-43的阳性表达（×400）

生长相关蛋白（Growth associated protein-43，GAP-43）是神经元特异性蛋白，主要存在于分化定性并开始轴突生长的神经元中，在脑功能活跃区（如：大脑皮质、海马）表达量很高。研究表明［6-9］，在神经系统的初期发育阶段中，GAP-43在神经元胞浆中的含量较高；随着脑的发育成熟，GAP-43的表达逐渐降低；当出现脑损伤时，其表达又会增高。因而将GAP-43 视为研究神经生长发育和损伤修复的重要标记物之一［10］。本实验观察到，在生长发育的各时间点，CIH 幼鼠大脑皮层神经元GAP-43表达均较对照组明显增强，并且表达高峰持续时间较长（4w），这与其他学者利用成年大鼠制作的各种脑损伤模型中观察到GAP-43出现短暂增高（3～14d）不同［9，11］，说明发育早期大鼠脑损伤后，脑组织自我修复非常活跃，提示缺氧性脑损伤后，神经系统启动保护机制并修复受损的神经元，通过GAP-43的不断增加促进突触的不断生长是神经进行修复的重要方式之一。

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