拉坦前列素滴眼液的抑菌效力研究

王虎斌，韦超，赵日秋，乔红群#（.南京工业大学药学院，南京0009；.南京生命能科技开发有限公司，南京 006）

拉坦前列素（Latanoprost）是1996年开发出的治疗青光眼和高眼压的新药。其是一种新型苯基替代的丙基酯前列素F2a，为选择性F2a受体激动药，无活性但能迅速渗透到角膜里，在角膜和血浆中可水解为具有活性的游离酸。拉坦前列素用量小，但房水通过眼角素层的流出量大，药液能渗透到眼球上睫脉络膜上层，具有良好降眼压效果[1-2]。自前列腺素衍生物应用以来，国内外已有许多研究[3-4]证明，拉坦前列素对原发性开角型青光眼和高眼压症有明显的降眼压作用。目前国家要求市场上的滴眼液必须选择合适的抑菌剂，苯扎氯铵是一种阳离子表面活性剂，属非氧化性杀菌剂，具有广谱、高效的抑菌效力，且用量适当时无任何不良反应，故本试验中采用苯扎氯铵作为拉坦前列素滴眼液的抑菌剂。另根据文献[5]报道，综合考虑苯扎氯铵的有效剂量以及眼部毒性，对0.005%（0.005g/100ml）、0.01%、0.015%、0.02%4个处方量进行本次研究的筛选。本研究根据2010年版《中国药典》（二部）抑菌剂效力检查法指导原则[6]要求，测定含不同处方量抑菌剂的拉坦前列素滴眼液对5种标准菌株的抑菌效力，从而确定处方中苯扎氯铵的使用量。

1 材料

1.1 仪器与设备

AKL1300C超净台（苏州市艾可林实验动物器材厂）；台式灭菌器3870（山东新华医疗器械股份有限公司）；微量移液枪（德国Ependoff公司，规格：20µl、500µl、5ml）。

1.2 药品、培养基与试剂

拉坦前列素滴眼液，处方Ⅰ（批号：20100817-1，0.005%苯扎氯铵）、处方Ⅱ（批号：20100817-2，0.01%苯扎氯铵）、处方Ⅲ（批号：20100817-3，0.015%苯扎氯铵）、处方Ⅳ（批号：20100817-4，0.02%苯扎氯铵）均由南京生命能科技开发有限公司提供；胰酪胨大豆琼脂培养基（批号：100518）和沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号：1003012）均由北京三药科技开发公司提供；0.9%氯化钠注射液（南京小营药业集团有限公司，批号：2010070106）。

1.3 菌株

铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]均由江苏省食品药品检验所提供，所有菌株传代次数均为第3代。

2 方法

2.1 检测菌菌液制备

接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至胰酪胨大豆琼脂培养基中，35℃培养24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基中，25℃培养48h。用0.9%氯化钠注射液将上述培养物的菌悬液校正至0.5麦氏比浊标准浓度（含菌数约为108CFU/ml），最后用0.9%氯化钠注射液将菌液1→10稀释至每1ml含菌数为50～100CFU的菌悬液。

接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基中，25℃培养7d，加入5ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%氯化钠注射液，将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%氯化钠注射液制成每1ml含孢子数50～100CFU的孢子悬液。

2.2 计数方法的验证

验证试验进行3次独立的平行试验，并分别按公式（回收率＝试验组平均菌数/菌液组平均菌数×100%）计算各试验菌每次试验的回收率。

2.2.1 菌液组。取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌稀释菌液各1ml，分别注入无菌平皿中，立即倾注胰酪胨大豆琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置于35℃培养48h，计数；取白色念珠菌、黑曲霉稀释菌液各1ml，分别注入无菌平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置25℃培养72h，计数。

2.2.2 试验组。取4种处方供试液1ml和50～100CFU试验菌，分别注入平皿中，立即倾注相应琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

2.3 抑菌效力测定

取包装完整的4种处方的供试品各20瓶，直接接种“2.1”项下制备的含菌数约为108CFU/ml的试验菌菌液，每一试验菌菌液接种4瓶，供试品中1ml接种菌数约为105～106CFU，每支接种菌液的体积25µl，充分混合，使供试品中的试验菌均匀分布。将接种的供试品置于25℃培养28d，避光，同时在0、7、14、28d分别依法检测供试液中的菌落数。菌落数检测方法：用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液将供试液稀释成1∶10、1∶102、1∶103、1∶104、1∶105、1∶106、1∶1077个稀释级，取各级稀释液1ml，置于无菌平皿中，注入20ml胰酪胨大豆琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基混匀，待凝固，倒置培养。每个稀释级每种培养基制备2个平皿；测定每份供试品中所含的菌数。同时取稀释液作阴性对照。根据《中国药典》规定，抑菌剂效力根据各间隔时间的菌数lg值相对于初始值（0时菌数lg值）减少程度进行评价。

3 结果

结果，4种处方样品3次计数方法验证试验的回收率均在70%以上，表明该样品可采用普通的菌落计数方法。4种处方对5种标准菌株的回收率试验结果见表1，4种处方对5种标准菌株的抑菌效力见图1。

表1 4种处方对5种标准菌株的回收率试验结果Tab 1 Results of recovery tests for 5kinds of standard strains in 4kinds of formulation

图1 4种处方对5种标准菌株的抑菌效力A.处方Ⅰ；B.处方Ⅱ；C.处方Ⅲ；D.处方ⅣFig 1 Antibacterial effects of 5standard strains in 4kinds of formulationA.formulationⅠ；B.formulationⅡ；C.formulationⅢ；D.formulationⅣ

从图1结果可看出，处方Ⅰ和处方Ⅱ对铜绿假单孢菌的抑菌效力不符合《中国药典》要求，而处方Ⅲ和处方Ⅳ均可以在28d内抑制5种标准菌株的菌体生长。由于处方Ⅲ的抑菌剂量比处方Ⅳ低，所以拉坦前列素滴眼液中苯扎氯铵的处方量建议为0.015%。

4 讨论

拉坦前列素是以异丙酯为存在形式的前体药物，其通过角膜被吸收，在酯酶的作用下水解成具有生物活性的酸，以增加房水的巩膜色素膜外流达到降低眼内压的作用。拉坦前列素因能逐渐改变眼的颜色，而被作为治疗开角型青光眼的二线药物[1]。本试验主要探讨了拉坦前列素滴眼液处方中抑菌剂苯扎氯铵的合理含量，为拉坦前列素的临床应用提供了试验依据。

2010年版《中国药典》中抑菌剂效力检查法指导原则对眼用制剂抑菌剂的使用有具体的规定[6]，为抑菌剂的合理使用指明了方向。本次试验主要探讨了处方中不同量抑菌剂对药物的影响，所以处方中其他组分及其浓度均相同，以后的试验可以对拉坦前列素滴眼液中其他组分对处方的影响进行研究。

[1] 张翠莲.拉坦前列素[J].中国新药杂志，1998，7（4）：329.

[2] 詹桂林.前列腺素治疗青光眼的最新进展[J].国外医学眼科学分册，1997，21（3）：129.

[3] 陈璐，童荣生，吕晶.降眼压新药：曲伏前列素[J].中国药房，2008，19（25）：1981.

[4] Aptel F，Cucherat M，Denis P.Efficacy and tolerability of prostaglandin analogs：a meta-analysis of randomized controlled clinical trials[J].J Glaucoma，2008，17（8）：667.

[5] 宁黎丽.眼用制剂研发过程中应关注抑菌剂的合理使用和质量控制[J].中国药学杂志，2007，42（23）：1836.

[6] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：二部[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：附录ⅪⅩN.