黄连解毒汤及其单味药精制前后抗血小板聚集作用的研究

周 静， 马兴苗， 邱碧菡， 潘林梅， 朱华旭， 范欣生

(南京中医药大学中药复方分离工程重点实验室，江苏南京 210029)

脑缺血时，大鼠脑能量代谢紊乱［1］，血液处于高凝、高黏、高聚状态，血栓的形成直接参与了脑缺血的发生发展，而血小板功能亢进促进血栓形成。抗血小板聚集，抑制血栓形成及有关机制对于防治缺血性脑血管疾病具有重要意义。黄连解毒汤对脑缺血损伤具有明显的保护作用［2］。本实验以黄连解毒汤为试验体系，以抑制兔血小板聚集率为指标，从对血小板聚集功能的影响方面探讨不同精制方法前后黄连解毒汤全方和单味药对家兔血小板聚集的影响，为黄连解毒汤的进一步研究提供依据。

1 仪器与试剂

STEELIEX血小板聚集凝血因子分析仪 (北京世帝科学仪器公司);LDZ5-2低速自动平衡离心机 (北京医用离心机厂)。

黄连Coptis chinensisFranch、黄柏Phellodendron chinensisSchneid.、黄芩Scutellaria baicalensisGeorgi、栀子Gardenia jasminoidesEllis等药材均购自安徽省亳州市药材总公司中药公司，经南京中医药大学吴启南教授鉴定符合《中国药典》标准;ADP(5'-腺苷二磷酸二钠盐)(上海伯奥生物科技有限公司，批号:20100430);柠檬酸三钠 (上海凌峰化学试剂有限公司，批号:030413);氯化钠注射液 (石家庄四药有限公司，批号:2010031702);大孔吸附树脂 (河北沧州宝恩化工有限公司);ZTC1+1澄清剂 (天津正天成澄清技术有限公司)。

2 动物

新西兰大耳白兔，雄性，体质量2.0～3.0 kg，由南京江宁县汤山青龙山动物繁殖场提供，实验动物生产许可证SCXK(苏)2002-0027，实验动物使用许可证:SYXK(苏)2002-0008。

3 方法

3.1 样品制备

3.1.1 全方提取液的制备 按处方比例称取各味药，浸泡0.5 h，加水煎煮2次:第1次加10倍量水，煎煮1.5 h;第2次加8倍量水，煎煮1 h，并分别用300目滤布滤过，合并滤液，待用。将一部分水提液离心 (5 000 r/min，15 min)，取上清液浓缩至0.1 g生药/mL，作为全方提取液(组1)，备用。

3.1.2 不同大孔树脂精制液的制备 将全方提取液 (组1)用不同树脂 (树脂量∶生药量为2.5∶1)吸附，并分别以10倍生药量蒸馏水，10倍生药量的70%乙醇洗脱。HPD100(组7)，AB-8树脂 (组8)，HPD450(组9)，洗脱液均浓缩至0.1 g生药/mL。

3.1.3 AB-8大孔树脂吸附后不同体积分数乙醇洗液的制备 将全方提取液 (组1)经过AB-8树脂 (树脂量∶生药量=2.5∶1)吸附，并分别以10倍生药量蒸馏水，10倍生药量不同体积分数乙醇洗脱。10%乙醇 (组10)，30%乙醇 (组11)，50%乙醇 (组12)，70%乙醇 (组8，洗脱液均浓缩至0.1 g生药/mL。

3.1.4 不同方法精制液的制备 AB-8树脂吸附组 (组8)，方法同3.1.2项中组8，洗脱液均浓缩至0.1 g生药/mL。

醇沉组 (组13)，全方提取液 (组1)，加乙醇至含乙醇为70%，放置24 h，滤过，得醇沉液［3］，醇沉液浓缩至0.1 g生药/mL。

絮凝组 (组14)，ZTC1+1 絮凝［4］。

A组分:先用少量蒸馏水搅成糊状，然后加入需要量的蒸馏水，溶胀24 h，搅拌，配置成1%黏胶液;B组分:先配制1%醋酸，然后用少量1%醋酸溶解B组分并搅成糊状，加入足够量的1%醋酸，溶胀24 h，搅拌，配置成1%黏胶液。用前分别摇匀。取全方提取液 (组1)，于80℃水浴上加入药液体积3%的B于浓缩液中，每隔30 min左右间隔搅拌1次，2 h后，同样方法在60℃时加入药液体积1.5%的A(B∶A=2∶1)，30～60 min后再搅拌1次。静置12 h，取上清液将其浓缩至0.1 g生药/mL。

3.1.5 单味药，单味药复配提取液及精制液的制备 黄连提取液 (组2)，黄柏提取液 (组3)，黄芩提取液 (组4)，栀子提取液 (组5)制备方法同全方提取液 (组1)。将上述四味药按处方比例重新组合得单味药复配提取液 (组6);精制液制备方法同3.1.2项中组8，黄连精制液 (组15)，黄柏精制液 (组16)，黄芩精制液 (组17)，栀子精制液 (组18)，单味药复配精制液 (组19)。

3.2 固体量的测定［5］精密移取0.1 g生药/mL的各组样品20 mL，置于已干燥至恒定质量的蒸发皿 (W1)中，水浴蒸干，于105℃烘箱中干燥3 h，置干燥器中冷却0.5 h，迅速称定质量 (W2)，计算固体的量。固体质量浓度(mg/mL)=(W2－W1)/20。

3.3 富、贫血小板血浆的制备［6］将家兔固定在兔架上，采用盐酸普鲁卡因局部麻醉，颈总动脉插管放血，用3.8%的柠檬酸三钠溶液以1∶9抗凝，以1 000 r/min离心10 min，取出即得富血小板血浆 (PRP)，剩余部分以3 000 r/min离心，取出即得贫血小板血浆 (PPP)，备调零。

4 结果

4.1 黄连解毒汤复方、单味药和单位复配上清液的比较采用血小板聚集功能测定法，测定黄连解毒汤复方、单味药和单味药复配提取液对家兔血小板聚集率的影响。其固体质量浓度、最大聚集率以及聚集抑制率结果见表1。

与空白对照组相比，给药组最大聚集率差异均有显著性 (P＜0.01);表明黄连解毒汤、单味药、单味药复配提取液均能使家兔血小板最大聚集率大幅下降。黄连解毒汤全方共煎 (组1)与其他组相比，固体质量浓度最低，其血小板最大聚集抑制率高达89.03%，比单味药材复配 (组6)、黄连 (组2)、黄柏 (组3)、黄芩 (组4)、栀子 (组5)提取液的抑制率高，见表1。

表1 全方与各单味药材及单味复配上清的比较

4.2 经不同树脂精制黄连解毒汤全方的比较 采用血小板聚集功能测定法，测定黄连解毒汤复方经不同极性大孔树脂精制液对家兔血小板聚集率的影响。其固体质量浓度、最大聚集率以及聚集抑制率结果见表2。

表2 全方经不同大孔树脂吸附精制液的比较

4.3 黄连解毒汤复方经AB-8树脂吸附后不同体积分数乙醇洗脱液比较 采用血小板聚集功能测定法，测定黄连解毒汤复方经AB-8大孔树脂吸附后不同体积分数乙醇洗脱精制液对家兔血小板聚集率的影响。其固体体积分数、最大聚集率以及聚集抑制率结果见表3。

表3 全方经AB-8树脂吸附后不同体积分数乙醇洗脱比较

4.4 不同精制方法黄连解毒汤复方精制液比较 采用血小板聚集功能测定法，测定黄连解毒汤复方经大孔树脂吸附、醇沉、絮凝后精制液对家兔血小板聚集率的影响。其固体质量浓度、最大聚集率以及聚集抑制率结果见表4。

表4 3种不同精制方法比较

与空白对照组相比，给药组最大聚集率差异均有显著性 (P＜0.01);表明不同精制方法后的黄连解毒汤、单味药、单味药复配药液均能使家兔血小板最大聚集率大幅下降。全方经大孔树脂，醇沉、ZTC絮凝等法精制后，发现经过弱极性大孔树脂AB-8吸附且70%乙醇洗组 (组8)的固体质量浓度低至0.29 mg/mL，而血小板最大聚集抑制率高达87.34%，比其他体积分数乙醇洗脱 (组10，11，12)，醇沉 (组 13)，絮凝 (组 14)，过非极性树脂HPD100(组7)，极性树脂HPD450(组9)的抑制率高，见表2～4。

4.5 黄连解毒汤复方、单味药材及复配树脂精制物比较采用血小板聚集功能测定法，测定黄连解毒汤复方、单味药材及复配提取液经大孔树脂吸附后精制液对家兔血小板聚集率的影响。其固体质量浓度、最大聚集率以及聚集抑制率结果见表5。

表5 全方树脂精制物与单味药材树脂精制物及复配的比较

与空白对照组相比，给药组最大聚集率差异均有显著性 (P＜0.01);表明树脂精制后的黄连解毒汤、单味药、单味药复配药液均能使家兔血小板最大聚集率大幅下降。全方 (组8)比复配单味 (组19)、黄连 (组15)、黄柏(组16)、黄芩 (组17)、栀子 (组18)精制液的最大聚集抑制率高，见表5。

结果表明，精制前后黄连解毒汤全方对血小板聚集的抑制作用优于单味药材复配、黄连、黄柏、黄芩、栀子单味药材;经树脂处理后，全方过弱极性的树脂AB-8，70%乙醇洗脱的固体质量浓度最低，对家兔的血小板抑制率最高。

5 讨论

5.1 中药复方由不同品类中的数种天然产物构成，不可避免地需要“去伪存真，去粗取精”因而依据不同需要，采用过滤、醇洗、醇沉、澄清剂、大孔树脂吸附等精制方法去除伴生物质，保留基本活性物质。不同的精制方法因技术原理不同，不仅对复方中指标性成分保留率不同且所除去的伴生物质的种类与多少也有差异，进而导致复方的药效有所不同［14］。

5.2 脑缺血是一种病理过程复杂的疾病，其发病过程涉及到脑血流减少、缺血缺氧和能量代谢衰竭及氧自由基产生、炎性因子和细胞的参与等，最终导致神经细胞溃变、死亡。血栓形成是脑缺血性疾病的主要致病因素之一;脑缺血时，凝血机制障碍导致血栓形成，成为脑缺血的重要病理机制之一。中药复方作为一个复杂体系可以从不同机制抑制脑缺血［7］，已有研究证实黄连解毒汤中的黄芩苷［8］、四氢巴马汀［9］、小檗碱［10］、栀子苷［11］具有抗脑缺血作用。本研究发现黄连解毒汤经过不同的方法处理前后对血小板聚集抑制率均有显著影响，但各组之间区别很大。

5.3 本实验从原液入手，发现全方共煎提取液对血小板聚集抑制率的影响要远远优于单味药的上清液以及分煎合并后的全方上清液。根据黄连解毒汤中有效成分的性质，选取了3种不同极性的大孔树脂，非极性的HPD100［12］，弱极性的 AB-8［13］，极性的 HPD450［14］，均用 70% 乙醇洗脱，经AB-8处理后的药液固体质量浓度大大降低且对家兔血小板聚集抑制率的影响甚大，为黄连解毒汤中有效成分的研究奠定的一定的基础。选定AB-8大孔树脂后，进一步优化洗脱乙醇体积分数，发现70%乙醇洗脱的优势明显高于其余几个体积分数。再与其他精制方法，醇沉、絮凝比较发现，经AB-8树脂处理，70%乙醇洗脱后的药液优势亦未见衰退。然后根据优选出的精制条件对全方、单味药和单味药复配上清液进行精制［15］，全方的血小板抑制率依旧高于其他组别。

综上，经弱极性大孔树脂AB-8吸附70%乙醇洗脱的黄连解毒汤全方固体质量浓度最低且血小板抑制率优势明显。

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