HPLC法测定肾茶中熊果酸与齐墩果酸

蓝晓玉

(广西柳州食品药品检验所，广西柳州 545006)

肾茶为唇形科植物肾茶Clerodendron spicatusThunb.的全草，又名猫须草、猫须公。分布于福建、台湾、海南、广西、云南西双版纳等地;味甘、微苦，性凉。化学成分为三萜类、甾醇类、黄酮类、挥发油及其他成分。三萜类的熊果酸与齐墩果酸是主要活性成分，具清热利湿，通淋排石作用［1-2］，民间多用于治急性或慢性肾炎、膀胱炎、尿路结石等［3-9］。目前采用HPLC法对肾茶药材中活性成分熊果酸与齐墩果酸的定量方法未见文献报道。本实验建立了HPLC法同时测定该药中熊果酸与齐墩果酸的量，结果表明该方法简便、快捷、准确，可为该药材的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

岛津LC—20AT高效液相色谱仪，紫外可见波长检测器;岛津UV—2550紫外可见分光光度计;梅特勒XS205电子分析天平。

肾茶药材为自采或购买，所有样品经本所李玲副主任中药师鉴定，均为唇形科植物肾茶Clerodendron spicatusThunb.正品。熊果酸对照品 (批号110742-200516)、齐墩果酸对照品 (批号110709-200304)购自中国药品生物制品检定所。甲醇、乙腈均为色谱纯，美国Fisher公司;超纯水为实验室自制。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 ZORBAX SB-Aq C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温35 ℃;甲醇-乙腈-0.05%醋酸铵溶液 (45∶30∶25)为流动相，体积流量1.0 mL/min;检测波长215 nm;进样量10 μL。

2.2 对照品混合溶液的制备 分别精密称取熊果酸对照品10.29 mg与齐墩果酸对照品10.19 mg，置同一25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，得熊果酸与齐墩果酸对照品混合贮备液。

2.3 供试品溶液的制备 精密称取肾茶药材粉末(编号SS2)(过3号筛)0.5 g，加20 mL乙醇浸泡过夜，超声 (50 Hz，300 W)提取30 min，过滤，滤渣加入乙醇20 mL，重复提取一次，用少量乙醇洗涤滤渣及滤纸，合并滤液，蒸干，用甲醇溶解并定容至5 mL，摇匀，即得。

2.4 线性关系试验 精密量取2.2项下对照品混合贮备液2、1、0.5、0.25、0.125 mL，分别置于2 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得到不同质量浓度的对照品混合溶液。精密吸取不同质量浓度的对照品混合溶液各10 μL，按上述色谱条件，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积，以色谱峰面积为Y纵坐标，熊果酸与齐墩果酸的质量浓度为X横坐标，进行线性回归分析，得熊果酸和齐墩果酸回归方程分别为Y=340 119X－15 068(r=1.000 0)，Y=337 469X－5 611(r=1.000 0)，线性范围分别为0.26～4.1 μg与0.25 ～4.1 μg。

2.5 精密度试验 精密取对照品混合溶液10 μL，连续进样6次，分别测定峰面积值，计算出熊果酸与齐墩果酸的RSD分别为1.8%和1.4%，表明仪器性能良好。

2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、16 h进样测定，其RSD分别为2.0%和1.7%，表明该供试品溶液稳定性良好。

2.7 系统适用性试验 精密量取供试品溶液与对照品混合溶液各10 μL，按上述色谱条件，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1，熊果酸与齐墩果酸峰达到基线分离，分离度大于1.5，二者理论塔板数大于3 000。

图1 溶剂空白 (A)，对照品 (B)和供试品 (C)色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of blank solvent(A)，reference substances(B)and sample(C)

2.8 重复性试验 精密称取同一样品6份，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件进行测定，结果样品中熊果酸与齐墩果酸量的均值为0.097% (RSD为1.2%)和0.059% (RSD为1.4%)。

2.9 加样回收试验 精密称取已测知熊果酸与齐墩果酸剂量的样品 (编号SS2)约0.25 g共6份，分别加入205.80 μg/mL熊果酸1.25 mL和203.80 μg/mL齐墩果酸0.70 mL，按供试品溶液的制备方法及色谱条件项下操作，计算回收率，结果肾茶药材中熊果酸与齐墩果酸的平均回收率 (n=6)96.85%(RSD为0.7%)和98.40% (RSD为1.0%)。结果见表1。

2.10 样品测定 取不同产地的肾茶药材0.5 g，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项 色谱条件进行测定，按外标法分别计算样品中熊果酸与齐墩果酸的量，结果见表2。

3 讨论

参照文献［10-11］分别尝试用甲醇索氏提取、先用乙醚索氏提取除去杂质再用甲醇索氏提取、25%盐酸-甲醇 (1∶4)回流提取、乙醇超声提取等方式，结果发现乙醇超声提取效果较好，且易操作。

表1 加样回收试验结果Tab.1 Results of recovery tests

经查阅文献，熊果酸与齐墩果酸的测定有采用蒸发光散射检测器也有采用紫外检测器的，考虑到相对于蒸发光散射检测器，紫外检测器的专属性及灵敏度更高，故本方法采用紫外检测器。考察熊果酸与齐墩果酸的紫外吸收图谱，二者在200～300 nm范围内均无明显最大吸收，参考文献选定215 nm为测定波长。在流动相考察中，选用甲醇-水系统时，峰形差，分离不好;选择甲醇-0.5%醋酸铵、甲醇-0.2%磷酸、甲醇-0.2%醋酸系统时基线波动严重，噪声过大;选用甲醇-0.05%醋酸铵系统时，峰高较低，峰形不够尖锐;选择乙腈-0.05%醋酸铵系统时，峰形虽有明显改善，但分离度达不到要求，采用甲醇-乙腈-0.05%醋酸铵(45∶30∶25)三相系统作为流动相时，分离度及峰形均能满足实验要求。

表2 样品测定结果 (n=5)Tab.2 Determination results(n=5)

有文献报道了用RP-HPLC法测定肾茶药材中迷迭香酸［12-13］、用薄层扫描法测定肾茶中熊果酸［14-15］，本实验建立了目前在药品质量控制中运用最广泛的HPLC法同时测定肾茶药材中主要活性成分熊果酸与齐墩果酸，结果表明该方法简便、快捷、准确，可为该药材的质量控制提供参考。

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