五脉绿绒蒿总黄酮和总生物碱抗大鼠肝纤维化

王志旺， 邵 晶， 郭 玫*， 王瑞琼， 任 远

(1.甘肃中医学院药学系，甘肃 兰州 730000;2.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃 兰州 730000;3.甘肃省高校中 (藏)药化学与质量研究省级重点实验室，甘肃兰州 730000)

罂粟科绿绒蒿属植物五脉绿绒蒿Meconopsis quintuplinerviaRegel在藏医临床上可用于治疗肝炎、肝的热症等病症［1］;前期研究显示五脉绿绒蒿及其有效部位 (如总黄酮)具有明显的镇痛、抗炎、体外抗氧化等作用［2-3］;本次实验设计了五脉绿绒蒿的各提取物 (醇提物、总黄酮与总生物碱及其混合物)对肝纤维化的影响，探讨五脉绿绒蒿抗大鼠肝纤维化的有效部位及其作用机制，为临床应用提供理论依据。五脉绿绒蒿保肝降酶的活性已有文章报道，现将其抗肝纤维化的实验结果汇报如下。

1 材料

1.1 动物 SPF级Wistar大鼠，体质量 (200±20)g，由甘肃中医学院实验动物中心提供，动物生产许可证SCXK(甘)2004-0006，甘肃中医学院实验动物中心饲养并进行实验。

1.2 药物 五脉绿绒蒿全草，经甘肃省临洮农校卢通宁高级讲师鉴定。秋水仙碱 (对照药)，西双版纳版纳药业责任有限公司生产，批号:20110711。

1.3 试剂 四氯化碳 (CCl4)，广东汕头市西陇化工厂生产;透明质酸、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原及板层素放免试剂盒，北京北方生物技术研究所产品;羟脯氨酸 (Hyp)试剂盒，南京建成生物工研究所产品。

2 方法

2.1 五脉绿绒蒿各受试药的制备 取药材粗粉适量，用90%乙醇回流提取，回收乙醇即得乙醇提取物 (醇提物)。将醇提物溶于蒸馏水中，用石油醚萃取除杂质后用1 mol/L HCl溶解，调pH值至2～3，过滤，滤液中主要含有生物碱，残留物即为黄酮类粗品。将黄酮粗品用1 mol/L NaOH溶解，调pH值至9～10，过滤，碱水层再用1 mol/L HCl调pH值至2～3，用乙酸乙酯萃取即得五脉绿绒蒿总黄酮。将上述含有生物碱的酸性滤液用浓氨水调pH值9～10，用三氨甲烷萃取即得五脉绿绒蒿总生物碱。总黄酮与总生物碱按提取率混合即得总黄酮和总生物碱提取物。分别精密称取五脉绿绒各提取部位适量，加入1.5%的吐温－80，制备各受试药的乳剂，另制备1.5%吐温－80对照液，冷藏备用。

2.2 分组、造模与给药 取Wistar大鼠按性别体质量分层随机分为8组，即正常对照组、模型对照组、秋水仙碱组 (0.1 mg/kg)、五脉绿绒蒿醇提物组 (1.803 g/kg)、五脉绿绒蒿黄酮和生物碱组(0.283 g/kg)、五脉绿绒蒿总黄酮高、低剂量组(0.141 g/kg、0.047 g/kg)、五脉绿绒蒿总生物碱组 (0.142 g/kg)。参照相关实验方法［4-5］，采用CCl4复合因素复制肝纤维化造模:给大鼠皮下注射40%CC14橄榄油3.0 mL/kg(首剂量5.0 mL/kg)，2次/周，连续6周;造模第3周与4周给予高脂低蛋白质饲料，整个造模期间饮用20%乙醇。正常对照组皮下注射等量橄榄油，普通饲养。各组大鼠从造模起每天按上述剂量灌胃各药物乳剂15 mL/kg，其中正常对照组与模型对照组给予对照液。

2.3 指标观测与方法 实验过程中模型对照组、秋水仙碱组与黄酮高剂量组各有一只大鼠死亡。实验第6周，大鼠末次给药24 h、禁食12 h后，用2%戊巴比妥麻醉，股静脉采血，分离血清并检测肝纤维化指标;摘取肝脏，观察外形、色泽、质地，在肝右叶固定位置取肝组织，行HE染色，观察病理学变化，并进行半定量分析［6］;同时取肝组织适量制成肝干粉，测定肝组织羟脯氨酸水平，按下式计算肝胶原蛋白水平。

胶原蛋白(μg/mg肝粉)=羟脯氨酸÷13.4%

3 结果

3.1 五脉绿绒蒿对肝纤维化大鼠体质量及肝指数的影响 实验结束时，与正常对照组比较，模型对照组大鼠的体质量显著降低、肝指数明显升高(P＜0.01);与模型对照组比较，五脉绿绒蒿醇提物组、黄碱组及黄酮高剂量组大鼠的体质量有所提高，五脉绿绒蒿提取物 (除生物碱组外)对大鼠肝指数有不同程度的降低作用。结果见表1。

3.2 五脉绿绒蒿对肝纤维化大鼠肝组织Hyp及胶原蛋白水平的影响 由表2可以看出，与正常对照组比较，模型对照组大鼠肝组织Hyp及胶原蛋白水平明显增加 (P＜0.01);与模型对照组比较，五脉绿绒蒿各提取物 (除生物碱外)能明显降低Hyp及胶原蛋白的水平。

3.3 五脉绿绒蒿对肝纤维化大鼠血清肝纤维化指标的影响 表3结果显示，与正常对照组比较，模型组大鼠肝纤维化指标明显升高 (P＜0.01);与模型对照组比较，五脉绿绒蒿提取物 (除生物碱组)可不同程度地降低血清透明质酸、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原及板层素水平。

表1 五脉绿绒蒿对肝纤维化大鼠体质量及肝指数的影响(±s)Tab.1 Effect of Meconopsis quintuplinervia on body weight and liver index of the hepatic fibrosis in rats(±s)

表1 五脉绿绒蒿对肝纤维化大鼠体质量及肝指数的影响(±s)Tab.1 Effect of Meconopsis quintuplinervia on body weight and liver index of the hepatic fibrosis in rats(±s)

注:与模型对照组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

组 别 动物/只 体质量/g第1天 第42天 肝指数/(mg·g－1)正常对照组 11 218.64±12.40 295.5±53.3＊＊ 28.46±4.05＊＊11 211.00±15.82 218.9±32.2 39.97±7.38模型对照组 10 216.27±20.86 223.5±31.2 43.48±6.57秋水仙碱组 10 211.18±16.69 230.1±41.1 37.17±5.61*醇提物组 11 216.55±16.32 262.5±38.1* 33.86±4.99＊＊黄酮和生物碱组 11 216.27±16.04 259.4±42.8* 34.20±5.35＊＊黄酮高剂量组 10 209.82±11.98 255.5±29.1* 34.57±5.42＊＊黄酮低剂量组 11 208.18±10.85 235.4±30.9 37.79±5.87*生物碱组

表2 五脉绿绒蒿对肝纤维化大鼠肝Hyp及胶原蛋白水平的影响(±s)Tab.2 Effect of Meconopsis quintuplinervia on Hyp and collagen fiber in hepatic tissue of the hepatic fibrosis in rats(±s)

表2 五脉绿绒蒿对肝纤维化大鼠肝Hyp及胶原蛋白水平的影响(±s)Tab.2 Effect of Meconopsis quintuplinervia on Hyp and collagen fiber in hepatic tissue of the hepatic fibrosis in rats(±s)

注:与模型对照组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与黄酮低剂量组比较，#P＜0.05。

组 别 动物/只 剂量原生药/(g·kg－1) 提取物/(g·kg－1) Hyp/(μg·mg－1) 胶原蛋白/(μg·mg－1)正常对照组 11 － 0.684±0.183＊＊ 5.105±1.363＊＊模型对照组 10 － 1.215±0.295 9.065±2.203秋水仙碱组 10 0.1 mg/kg 0.652±0.194＊＊ 4.865±1.446＊＊醇提物组 11 15 1.803 0.713±0.185＊＊ 5.320±1.377＊＊黄酮和生物碱组 11 15 0.283 0.735±0.194＊＊ 5.482±1.451＊＊黄酮高剂量组 10 15 0.141 0.745 ±0.192＊＊# 5.562 ±1.434＊＊#黄酮低剂量组 11 5 0.047 0.979±0.202* 7.308±1.506*生物碱组11 15 0.142 1.147±0.248 8.561±1.853

表3 五脉绿绒蒿对大鼠肝纤维化指标的影响(±s)Tab.3 Effect of Meconopsis quintuplinervia on the contents of liver fibrosis of the hepatic fibrosis in rats(±s)

表3 五脉绿绒蒿对大鼠肝纤维化指标的影响(±s)Tab.3 Effect of Meconopsis quintuplinervia on the contents of liver fibrosis of the hepatic fibrosis in rats(±s)

注:与模型对照组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与黄酮低剂量组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组 别 动物/只 透明质酸/(μg·L－1) Ⅲ型前胶原/(μg·L－1) Ⅳ型胶原/(μg·L－1) 板层素/(μg·L－1)正常对照组 11 75.07±9.94＊＊ 61.04±8.18＊＊ 64.71±11.57＊＊ 94.74±12.19＊＊模型对照组 10 156.51±18.31 101.61±15.34 94.63±15.79 164.21±19.07秋水仙碱组 10 96.16±16.80＊＊ 75.34±9.46＊＊ 69.83±12.43＊＊ 116.35±17.06＊＊醇提物组 11 102.25±17.82＊＊ 83.06±10.12＊＊ 71.59±12.87＊＊ 109.53±15.46＊＊黄酮和生物碱组 11 106.84±18.84＊＊ 86.61±10.44* 72.68±12.96＊＊ 110.69±16.36＊＊黄酮高剂量组 10 109.86±19.99＊＊ 83.42±10.50＊＊ 70.22±12.83＊＊# 113.38±16.37＊＊##黄酮低剂量组 11 127.46±21.47＊＊ 88.83±10.68* 83.32±13.95 147.37±17.65*生物碱组 11 136.67±22.52*91.68±12.31 88.71±14.07 154.69±18.25

3.4 五脉绿绒蒿对大鼠肝组织纤维化病理变化的影响 正常对照组大鼠肝脏呈紫红色，表面光滑均匀;模型对照组大鼠肝脏表面发暗并有暗黄色颗粒，质地硬脆;五脉绿绒蒿各提取物组动物肝脏病理变化有一定改善。在显微镜下，正常对照组肝小叶结构完整，肝细胞排列规则 (图1-A);模型对照组肝小叶结构破坏，肝细胞排列紊乱，大量胶原沉积 (图1-B);各给药组 (除生物碱组)虽可见纤维形成的现象，但程度较轻 (图1-C、1-D、1-E、1-F、1-G)。对肝脏病理变化进行半定量分析，表4结果显示五脉绿绒蒿醇提物、黄碱组及总黄酮能明显减轻大鼠肝纤维变 (P＜0.05、0.01)。

4 讨论

肝纤维化是肝脏组织对慢性损伤的修复反应，是大多数慢性肝病共同的病理特征，目前多数学者认为肝纤维化进程可逆，故防治肝纤维化是肝病防治的重要环节［7］。藏药五脉绿绒蒿 (五脉绿绒蒿)在藏医典籍中记载可用于治疗肝炎、胆囊炎、肺炎［8］，临床上由五脉绿绒蒿等药物组成的复方用于治疗慢性肝炎取得了较好的疗效［9-10］。本课题组在五脉绿绒蒿抗炎、抗氧化有效的基础上，观察五脉绿绒蒿不同提取部位抗肝纤维化的作用。研究结果显示，五脉绿绒蒿醇提物、总黄酮及其与总生物碱的混合物可不同程度地促进大鼠体质量的增加，降低肝指数与血清肝酶水平 (该内容另有文章报道)，减轻大鼠肝纤维病理变化。

图1 五脉绿绒蒿对肝纤维化大鼠肝脏病理的影响 (HE染色，×20)Fig.1 Effect of Meconopsis quintuplinervia on liver tissue histological changes in rats(HE staining， ×20)

表4 五脉绿绒蒿对大鼠肝脏胶原纤维增生的影响(±s)Tab.4 Effect of Meconopsis quintuplinervia on comparison of liver collagen fibers hyperplasia in rats(±s)

表4 五脉绿绒蒿对大鼠肝脏胶原纤维增生的影响(±s)Tab.4 Effect of Meconopsis quintuplinervia on comparison of liver collagen fibers hyperplasia in rats(±s)

注:与模型对照组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与黄酮低剂量组比较，#P＜0.05。

组 别 动物/只 肝脏纤维增生程度分期/例0ⅠⅡⅢⅣ肝纤维化计分/分正常对照组 11 11 0 0 0 0 0.91±0.38＊＊模型对照组 10 0 0 4 5 1 5.14±1.12秋水仙碱组 10 0 7 2 1 0 2.86 ±1.00＊＊醇提物组 11 1 6 4 0 0 2.77 ±0.85＊＊黄酮和生物碱组 11 1 6 4 0 0 2.91±0.94＊＊黄酮高剂量组 10 1 7 1 1 0 2.82 ±0.90＊＊#黄酮低剂量组 11 0 5 4 2 0 3.91±1.09*生物碱组11 0 3 4 4 0 4.27±1.13

在肝纤维化过程中，肝细胞外胶原组织明显增多［11］，实验结果显示，五脉绿绒蒿醇提物、总黄酮及其与总生物碱的混合物能使肝纤维化大鼠肝组织中羟脯氨酸与胶原蛋白水平明显降低，显示出明显的抗肝纤维化作用。血清透明质酸、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原及板层素是反映肝纤维化非常重要的指标，透明质酸是细胞外基质的主要组成成分，肝纤维化早期血液中透明质酸即显著增加，是反应肝纤维化最有价值的血清标志物;板层素是一种非胶原结构糖蛋白，在肝内与Ⅳ型胶原共同分布，其大量沉积可引起肝窦毛细血管化及汇管区纤维化，血清板层素是反应基底胶原更新的指标;血清Ⅲ型前胶原水平的升高则提示肝纤维化处于活动期［12］。本次实验结果提示五脉绿绒蒿醇提物及其总黄酮能显著减低血清透明质酸、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原及板层素水平。

实验过程中，五脉绿绒蒿总生物碱抗肝纤维化的作用不明显;同时醇提物、总黄酮及其与总生物碱的混合物抗肝纤维化作用之间没有统计学意义，提示总黄酮是五脉绿绒蒿抗肝纤维化的主要有效部位，这与本研究组前期研究，即五脉绿绒蒿总黄酮具有抗炎、抗氧化的作用相一致。

［1］杨永昌.藏药志［M］.西宁:青海人民出版社，1991:465-465.

［2］王志旺，郭 枚，马 骏，等.五脉绿绒蒿抗炎镇痛作用有效部位的研究［J］.中国中医药信息杂志，2010，17(1):21-22.

［3］王志旺，张 扬，程 芳，等.五脉绿绒蒿总黄酮及其中苜蓿素的体外抗氧化活性［J］.中国老年学杂志，2011，31(22):4381-4383.

［4］张万国，胡晋红.桑黄预防大鼠肝纤维化作用的实验研究［J］.药学服务与研究，2002，2(2):82-84.

［5］曹正柳，资晓飞，熊耀斌，等.金水宝胶囊对肝纤维化大鼠模型TIMP-1及HA等的影响［J］.中成药，2011，33(9):1497-1499.

［6］中华肝脏病协会肝纤维化学组.肝纤维化诊断及疗效评估共识［J］.中华肝脏病杂志，2002，10(5):327-328.

［7］Povero D，Busletta C，Novo E，et al.Liver fibrosis:adynamic and potentially reversible process［J］.Histol Histopathol，2010，25(8):1075-1091.

［8］冯志舟.绿绒蒿及其药用价值［J］.云南林业，2004，25(5):24-24.

［9］韩香英.藏药治疗慢性乙型肝炎的近期疗效观察［J］.中国民族民间医药杂志，2004，69(4):210-210.

［10］马子琪.八味茵陈散治愈重症肝炎一例［J］.青海医药杂志，1990，33(4):49-49.

［11］青献春，刘丙辰，裴香萍，等.软肝散结胶囊抗大鼠肝纤维化实验研究［J］.中国实验方剂学杂志，2010，16(15):149-151.

［12］Bolarin D M，Azinge E C.Biochemical markers，extra-cellular components in liver fibrosis and cirrhosis［J］.Nig Q J Hosp Med，2007，17(1):42-52.