大孔吸附树脂纯化山橿总黄酮的工艺研究

陈随清， 陈磊磊， 魏雅磊， 尚朝利

(河南中医学院，河南郑州 450008)

山橿Lindera reflexaHemsl.系樟科Lauaceae山胡椒属植物，其根性温、味辛，具有行气止痛、健脾消积、活血消肿等作用［1-2］。在河南省民间用于治疗慢性胃炎，胃溃疡，有很长的应用历史，以山橿为主要原料生产的中成药制剂“胃痛宁片”，临床疗效确切［3］。现有文献研究表明，山橿主要含有黄酮类，生物碱类和挥发油类等成分［4］;本实验室前期研究证明，以球松素为代表的黄酮类成分为主要有效部位之一［5］，并优化了总黄酮部位的提取工艺。本实验进一步对山橿提取物中的总黄酮进行了纯化研究，实验中考察了大孔吸附树脂进行纯化的工艺参数，结果处理时综合分析了收膏率，总黄酮收率和球松素收率3个指标，用综合得分进行评价，最终确定的工艺能够得到纯度较高的山橿总黄酮，为山橿的进一步开发研究提供了实验依据。

1 材料、试剂与仪器

山橿药材 (2010年采自于河南省新县，经河南中医学院陈随清教授鉴定为樟科Lauraceae山胡椒属植物山橿Lindera reflexaHemsl.的根);球松素 (由本实验室从山橿中分离得到，用HPLC法测定其纯度达到99.05%)。

甲醇为色谱纯 (天津市四友精细化学品有限公司);其他试剂为分析纯 (天津市化学试剂三厂);大孔吸附树脂:HPD-450、HPD-600、D101(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)，DM130、860021(山东鲁抗立科药物化学有限公司)，HP20(日本三菱化学株式会社)。

高效液相色谱仪LC-20AT(日本岛津公司)，紫外检测器SPD-20A(日本岛津公司)，色谱工作站CBM-102(日本岛津公司)，电子天平(BS224S，北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

2 方法与结果

2.1 对照品和样品溶液的制备

对照品溶液的制备 精密称取干燥的球松素标准品，加甲醇溶解分别配制成0.22 mg/mL，1.005 mg/mL的对照品溶液。

样品溶液的制备 取山橿药材粗粉适量，分别加入12倍量70%乙醇超声提取3次，每次1.0 h，回收乙醇，浓缩;称取浸膏，加甲醇超声溶解，滤过，定溶，即得。

2.2 总黄酮的测定

2.2.1 检测波长的考察 分别取适量对照品溶液和样品溶液，在200～600 nm波长范围扫描，对照品和样品最大吸收波长都在286 nm处，确定286 nm作为总黄酮紫外检测波长，见图1。

图1 200～600 nm紫外吸收光谱图Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of 200-600 nm

2.2.2 线性关系考察 取质量浓度0.22 mg/mL的对照品溶液，稀释配制成质量浓度2.20、4.40、8.80、11.00、13.20、17.60 μg/mL 的标准品溶液，分别连续3次测定吸光度，以对照品浓度为横坐标，平均吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，结果表明球松素质量浓度在2.20～17.60 μg/mL之间线性关系良好，线性方程为Y=0.081X+0.008，r=0.999 4。

2.2.3 样品中总黄酮的含量测定 按2.1项下样品溶液制备方法，精密称取0.1 g浸膏，甲醇超声溶解并定容至50 mL，再精密吸取0.1 mL定容至10 mL，于286 nm测定吸光度，计算样品溶液中的总黄酮量。

2.2.4 方法学考察 通过精密度，稳定性，重复性的考察，表明该方法对总黄酮的测定稳定、可行。

回收率考察 精密称取适量的山橿药材样品6份，分别加入一定量的球松素标准品，按2.1项下方法制备样品溶液，2.2.3项方法测定，计算平均回收率为99.78%，RSD为2.94%，表明该方法回收率良好。结果见表1。

2.3 球松素检测方法

2.3.1 HPLC色谱条件 选择phenomenex luna 5 μ C18色谱柱 (250 mm×4.60 mm)，检测波长297 nm;柱温为30℃;体积流量为1.0 mL/min;进样量为10 μL;流动相条件按表2梯度洗脱，能达到较好的分离效果，见图2。

表1 回收率试验结果Tab.1 Results of recovery tests

表2 梯度洗脱程序Tab.2 Gradient elution program

图2 山橿HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of Lindera reflexa Hemsl.

2.3.2 线性关系考察 取1.005 mg/mL球松素标准品溶液，分别精密吸取2、5、10、15、20μL注入高效液相色谱仪，按2.3.1项HPLC条件测定峰面积。以进样量为横坐标，峰面积均值为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明，球松素进样量在2.01～20.10 μg范围内线性关系良好，线性方程为Y=2 896 600X+50 479，r=0.999 7。

2.3.3 样品中球松素测定 按2.1项下样品溶液制备方法，精密称取0.1 g浸膏，甲醇超声溶解，滤过，定容至50 mL，0.45 μm滤膜过滤;按2.3.1项HPLC条件进行测定，计算样品中球松素的量。

2.3.4 方法学考察 通过精密度，稳定性，重复性的考察，表明该测定方法稳定、可行。

回收率考察，精密称取适量的山橿药材样品6份，分别加入一定量的球松素标准品，按2.1项下方法制备样品溶液，按2.3.1项HPLC条件进行测定，计算样品中球松素的回收率。平均回收率为99.33%，RSD为2.69%，表明该方法回收率良好。结果见表3。

表3 回收率试验结果Tab.3 Results of recovery tests

2.4 综合评价方法

为了把多个量纲不同的统计指标，转化成无量纲的相对评价值，并综合这些评价值得出一个整体评价，本实验选用了多指标综合评价方法。

运用多指标综合分析时，首先对各变量按相应的方法作标准化变换，消除原变量量纲、数量级的不同带来的影响［6］，本实验选择Z-score法对指标进行变换，公式如下:

经过变换后的数据均值为0，方差为l。

数据标准化后，根据各指标对结果的不同影响程度，采用主观赋权法，对不同指标分别赋予不同的权重系数:球松素回收率权重系数0.4，收膏率和总黄酮回收率权重系数同为0.3，指数系数设定为100，计算综合得分。

综合评分公式为:

Y=(0.3×ZX1+0.3×ZX2+0.4×ZX3)×100，ZX为标准化的数据。

2.5 工艺条件考察

2.5.1 树脂预处理 树脂先用95%乙醇浸泡12 h后，湿法装柱，用95%乙醇清洗至乙醇洗脱液与水混合 (1∶5)不呈白色混浊，蒸馏水洗至无醇味，备用。

2.5.2 大孔吸附树脂型号的选择 根据树脂的极性、粒径和孔径等参数，选用经过预处理的三个厂家的六个型号的树脂，加入样品液进行静态吸附考察，分别计算干膏的吸附率和解吸率，运用紫外分光光度法测定总黄酮的吸附率和解吸率，用HPLC法测定球松素的吸附率和解吸率，并综合分析法计算综合得分，比较综合得分，DM130型适于山橿总黄酮的纯化，结果见表4。

表4 不同型号树脂吸附洗脱结果Tab.4 Results of different types of resin adsorption elution tests

2.5.3 上样浓度的考察 S样品液稀释至质量浓度为 0.02、0.033、0.05、0.1 g/mL，分别通过DM130树脂上样，洗脱，检测，计算洗脱液收膏率，总黄酮回收率和球松素回收率。综合评价结果，选取上样质量浓度为0.05 g/mL。结果见表5。

表5 不同上样浓度测定结果Tab.5 Determination results of different concentrations of samples

2.5.4 上样流速的考察 取质量浓度0.05 g/mL样品液，分别按0.5、1.0、1.5、2.0 mL/mim的体积流量进行上样，洗脱，检测，计算洗脱液收膏率，总黄酮回收率和球松素回收率。综合评价，选取上样流速为1.0 mL/mim。结果见表6。

表6 不同上样流速测定结果Tab.6 Measurement results of different samples flow velocity

2.5.5 上样径高比的考察 样品液0.05 g/mL，体积流量1.0 mL/min，分别通过径高比为1∶4、1∶6、1∶8、1∶10的树脂柱进行上样，洗脱，分别检测，计算洗脱液收膏率，总黄酮回收率和球松素回收率。综合评价，选取径高比为1∶8。结果见表7。

2.5.6 树脂最大上样量的考察 取DM130型树脂40 mL，样品液0.05 g/mL按体积流量1.0 mL/min进行上样。分份收集流出液，每10 mL收集一份，共收集20份，薄层 (乙酸乙酯－石油醚=1∶5)展开后，喷三氯化铝显色，紫外荧光检视球松素显黄绿色荧光。第14管出现球松素斑点，说明从140 mL开始出现泄漏。

表7 不同径高比考察结果Tab.7 Investigation results of different diameter ratio

最大上样量的考察，取DM130型树脂40 mL，按体积流量1.0 mL/min分别上样品液 (0.05 g/mL)120、140、160、180 mL，吸附，洗脱，分别检测，计算洗脱液收膏率，总黄酮回收率和球松素回收率。综合评价，确定160 mL相当于4倍树脂量为最大上样体积。结果见表8。

表8 最大上样量考察结果Tab.8 Investigation results of maximum sample quantity

2.5.7 除杂用水量的考察 取40 mL完成上样的DM130树脂，分别加入80、120、160、200 mL纯水除杂，洗脱，除杂效果直接影响产物的纯度，分别检测，计算洗脱液中总黄酮和球松素回收率和含量，结果见表9。

表9 不同体积水除杂考察结果Tab.9 Inspection results of different volumes of water impurity

洗脱用水量使总黄酮和球松素的含量增加，当用洗脱水量超过160 mL(4倍树脂量)时，总黄酮和球松素的回收率明显降低，故选取4倍量为除杂用水量。

2.5.8 洗脱液浓度的确定 取完成上样并除杂后的树脂柱4根，分别用30%、50%、70%、95%乙醇洗脱，并检测，计算洗脱液收膏率，总黄酮回收率和球松素回收率，综合考虑评价结果和生产成本因素，选取70%乙醇作为洗脱液。结果见表10。

表10 不同洗脱液浓度考察结果Tab.10 Results of different elution concentrations

2.5.9 洗脱速率的考察 取已完成上样的树脂柱4根，按体积流量1.0 mL/min，4倍量纯水除杂后，用70%乙醇按不同体积流量进行洗脱，分别检测，计算洗脱液收膏率，总黄酮回收率和球松素回收率。洗脱体积流量增大3个指标变化不大，当体积流量大于1.5 mL/min时各项3个回收率明显减小，综合考虑评价结果和时间因素，选取1.5 mL/min作为洗脱体积流量。结果见表11。

表11 不同洗脱速率考察结果Tab.11 Investigation results of different elution rates

2.5.10 洗脱液用量的考察 分别用不同量的70%乙醇洗脱，检测，计算收膏率，总黄酮回收率和球松素回收率。当洗脱液用量为160 mL时，总黄酮和球松素基本洗脱完全，选取洗脱液用量160 mL(4倍树脂量)。结果见表12。

表12 不同洗脱乙醇量考察结果Tab.12 Investigation results of different elution volumes of alcohol

2.5.11 树脂重复使用次数的考察 用确定上样条件和洗脱条件，连续4次对同一根树脂柱进行重复上样，洗脱。比较不同上样次数的收膏率，总黄酮回收率和球松素回收率。结果第4次使用时吸附效率显著降低，所以树脂可重复上样3次，需再生。结果见表13。

表13 树脂重复试验次数考察结果Tab.13 Investigation results of resin repeat test times

2.6 纯化工艺条件验证

按照以上确定的条件:DM130型树脂，按径高比1∶8装柱，4倍量质量浓度为0.05 g/mL样品液，体积流量1.0 mL/min上样，上样完成后静置2 h，以4倍量的纯水除杂，4倍量的70%乙醇洗脱，进行工艺验证试验 (n=3)，纯化的总黄酮由27.1%达到50.0%以上，球松素的量由4.1%达到9.0%以上。结果见表14。

表14 纯化工艺验证Tab.14 Purification of process validation

3 讨论

由于山橿黄酮类成分极性差异较大，所以首先选择了沧州宝恩吸附材料科技有限公司、山东鲁抗立科药物化学有限公司、日本三菱化学株式会社3个厂家的11个型号的树脂进行了静态吸附考察，从中优选了效果较好的6个型号进行动态吸附，最终确定了DM130树脂吸附效果较好，能够获得纯度较高的产物。

为了保证纯化过程中主要成分不流失，本实验选择指标性成分球松素、总黄酮和收膏率3个指标对工艺进行考核;参考相关文献 ［7］，同时用主要特征指纹峰面积的保留率评价山橿总黄酮精制效果，试验结果证明11个主要成分峰全部保留，峰面积比例未改变，说明纯化过程对总黄酮的主要成分组成保留效果较好。见图3和图4。

图3 山橿HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of Lindera reflexa Hemsl.

图4 树脂纯化后样品HPLC图谱Fig.4 HPLC chromatogram of sample with resin purification

［1］崔鸿宾.山胡椒属系统的研究［J］.植物分类学报，1987，25(3):167-171.

［2］《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编［M］下册。北京:人民卫生出版社，1978.

［3］河南省卫生厅.河南省药品标准［S］.郑州:河南科技出版社，1984.

［4］张均增，方起程.山橿化学成分的研究［J］.中草药，1994，25(11):565-568.

［5］张 峰.山橿活性部位筛选及其指纹图谱研究［D］.郑州:河南中医学院，2009.

［6］邱 东.多指标综合评价方法的系统分析［M］.北京:中国统计出版社，1991.

［7］黄月纯，黄樱华，刘翠玲.大孔吸附树脂纯化侧柏叶总黄酮的工艺研究［J］.中药新药与临床药理，2010，21(1):75-80.

［8］张 彤，徐莲英，陶建生.多指标综合评分法优选葛根提取工艺［J］.中草药，2004，35(1):38-40.