CdTe量子点作探针共振瑞利散射法测定鲑精蛋白

刘 丹，杨 莉，张 萍，罗飞华

（四川文理学院 化学与化学工程系，四川 达州 635000）

1 引言

量子点（quantum dots，QDs）又称半导体纳米晶（semiconductor nanocrystal），通常是由IIB－VIA族或IIIB－VA族原子构成的，粒径尺寸在1～10nm之间的纳米颗粒，具有独特的物理和化学性质。最近几年以来，量子点被用作生物探针的研究备受国内外科研工作人员的广泛关注，目前研究较多的是CdX（X＝S、Se、Te）QDs，最有前途的应用领域是在生物体系测定中作为荧光探针。相比于有机荧光分子，用QDs标记细胞、蛋白质和核酸等具有更好的荧光特性，它的相关应用研究，将促进超灵敏度、高稳定性以及长发光寿命的生物检测技术的发展[1]。

鲑精蛋白（Salmine，Sal）是鲑鱼精子中发现的一种鱼精蛋白，它是一种天然存在于鲑鱼成熟精细胞组织中、与DNA紧密结合在一起的一种32个氨基酸残基的阳离子肽，显强碱性，等电点为12.1，其中精氨酸成分极高，近年来，Sal在医疗卫生和食品行业具有广阔的应用前景[2]，目前用CdTe QDs作探针共振瑞利散射法研究Sal的方法还未见报道[3]。

2 材料与方法

2.1 仪器与试剂

仪器：Hitachi F－2500型荧光分光光度计（日本岛津），测定参数：狭缝宽度5nm；pHS－3C型精密酸度计（中国上海精密科学仪器有限公司）。

试剂：单质碲（Te，国药集团化学试剂有限公司），氯化镉（CdC12·2.5H2O，上海试剂二厂），硼氢化钠（NaBH4，天津市环威精细化工有限公司），巯基乙酸（C2H4O2S简写TGA，国药集团化学试剂有限公司，AR），氢氧化钠（NaOH，1mol·L－1），硫酸（H2SO4，0.5mol·L－1）Britton－Robinson（BR）缓冲溶液。BR缓冲溶液：用0.2NNaOH 溶液和0.04NH3PO4，H3BO3和HAc溶液按一定的比例混合后，配成不同pH值的缓冲溶液，并用酸度计校正其pH值。其余试剂均为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水。

2.2 TGA－CdTe QDs的合成

选用50mL三颈烧瓶，通入N2作为保护气，搅拌，将0.0194g Te粉溶于10mL蒸馏水中，加入适量NaBH4，一段时间后，黑色Te粉消失，瓶内溶液变得无色澄清透明，制得NaHTe溶液，备用[4]。

在250mL三颈瓶中加入0.0687g CdCl2·2.5H2O溶液，N2做保护气，搅拌，加入0.05mL的巯基乙酸，用1mol·L－1的 NaOH溶液调节pH值为11.5，然后向制得的NaHTe溶液中在适当搅拌速度下缓慢注入一定量的0.5mol·L－1的 H2SO4，并将生成的H2Te气体用N2载入到CdCl2溶液中，直至颜色稳定不变。升温至95℃ ，反应回流6h后得到橙黄色液体，即得TGA－CdTe QDs溶液（2×10－3mol／L）。

2.3 测定方法

选用10.0mL的比色管，依次加入2×10－3mol·L－1CdTe QDs1.5mL、pH 值为8.0BR缓冲液1.0mL和适量Sal样品溶液，用水稀释至10.0mL，摇匀，静置，室温下反应10min，在荧光分光光度计上选择以λex＝λem，在220～800nm范围内进行同步扫描，狭缝宽度为5nm，获得RRS光谱，在最大共振瑞利散射峰（λmax）处测定体系的RRS强度IRRS和试剂空白的RRS强度I0，且ΔIRRS＝IRRS－I0。

3 结果与讨论

3.1 CdTe QDs－Sal体系的RRS光谱

图1为CdTe QDs与Sal相互作用的共振散射光谱，当CdTe QDs或Sal单独存在时，它们各自的散射强度（RRS）都很弱；当两者同时存在时，二者结合形成新的结合物，RRS光谱显著增强，如图2中的CdTe QDs－Sal体系的RRS光谱所示，其最大散射峰位于312nm。

图2 CdTe QDs－Sal体系的荧光光谱

图1为CdTe QDs－Sal体系的散射光谱，由图1可知，当TGA－CdTe QDs与Sal结合时，散射明显增强，且散射强度在一定范围内随Sal浓度的增大而成线性增强，可以用于Sal的定量检测。

3.2 CdTe QDs－Sal体系的荧光光谱

从图2可以看出，QDs与Sal相互作用后，Sal能够猝灭QDs的荧光，并且QDs的荧光强度随着鲑精蛋白浓度的增大而逐渐减弱，同时伴随着荧光发射峰位有规律地红移。

3.3 体系适宜的反应条件

3.3.1 酸度的影响

通过实验测定了CdTe QDs－Sal体系的最佳反应条件，实验结果显示，选择BR缓冲溶液做介质时，实验效果最佳，最佳的pH值范围为7.5～8.5，用量为0.6～1.2mL，实验选用1.0mL的pH值为8.0的BR缓冲溶液来调节体系酸度。

3.3.2 TGA－CdTe QDs浓度的影响

实验研究了CdTe QDs用量对体系RRS强度的影响，结果表明：CdTe QDs溶液适宜用量为1.2～1.6 mL，CdTe QDs的用量过量或不足都将会影响实验效果，实验确定CdTe QDs的最佳用量为1.5mL（CdTe QDs浓度为2×10－3mol·L－1）。

3.3.3 反应时间的影响

实验测定了在不同的反应时间，体系的RRS强度。在室温下，按实验方法将各试剂加完混匀后，该体系的ΔIRRS从反应开始逐渐增强，在10min后反应完全，2h之内散射强度基本保持稳定，故实验选在反应完毕放置10min后立即进行测量。

3.4 标准曲线

在最佳反应条件下，以不同浓度的鲑精蛋白与CdTe QDs反应，10min后在最大波长处测量CdTe QDs－Sal体系的 RRS强度（IRRS），求出散射强度（ΔIRRS）后，以ΔIRRS对鲑精蛋白浓度作图绘制标准曲线，线性范围为：0.016～2.4μg／mL，线性方程：ΔI ＝233.25＋947.54C，相关系数为0.9969，检出限为5.00 ng／mL。

3.5 共存物质的影响

在鲑精蛋白浓度为2.5μg·mL－1时，相对误差为10%范围内，实验考察了一些常见干扰物质对鲑精蛋白的影响，结果如表1所示。其中糖类对体系的影响较小，允许浓度较大；部分无机离子对体系的影响也较小，允许浓度较大；由于实验是在碱性环境中进行的，某些金属离子允许浓度较小，实验中应使用掩蔽剂，减小其对体系的影响。

表1 CdTe QDs－Sal体系共存物质的影响（CSal＝2.5μg·mL－1）

3.6 RRS增强的原因

3.6.1 分子体积增大

众所周知分子体积的增大直接影响到散射强度的提高[5]。在弱碱性的缓冲溶液中带正电的sal和带负电的巯基乙酸修饰的量子点通过静电引力和氢键结合在一起。随着聚集到量子点表面的sal的量增多而使量子点的表面带正电，这样量子点又结合另一个带有正电的量子点而最终导致量子点的聚集，导致分子体积的增大，RRS显著增强。

3.6.2 CdTe QDs与鲑精蛋白共振增强散射效应

当Rayleigh散射的波长位于分子的吸收带的附近时，散射强度将急剧增大，这种现象即为共振瑞利散射。由实验知，产生增强的瑞利散射效应。

3.6.3 疏水性增强

反应前，带负电荷的CdTe QDs和带正电荷的鲑精蛋白均有较好的亲水性，它们在水溶液中易形成水合物，因而RRS均很微弱。而当CdTe QDs与鲑精蛋白结合后，形成的聚合物成电中性，导致疏水性增加，从而可能形成一种疏水的液—固界面与水形成一种固—液界面，这种界面的形成有利于RRS光谱增强[6]。

3.7 荧光猝灭的原因

在弱碱性条件下，带负电的CdTe QDs与带正电的鲑精蛋白通过静电引力及疏水作用力相互作用，导致QDs的荧光猝灭[7]。由CdTe QDs与鲑精蛋白相互作用的荧光光谱和RRS光谱得知，向CdTe QDs溶液中加入一定量的鲑精蛋白后，两者结合形成大的结合物，这种结合物使得QDs的荧光猝灭，同时伴随着发射峰位的红移。从紫外光谱图4也可以看出，鲑精蛋白与QDs之间存在着强烈的相互作用，结合后有新的吸收峰形成。由此可以说明，在pH值为8的弱碱性条件下，带正电的鲑精蛋白与带负电的CdTe QDs通过静电引力及疏水作用力结合，形成不发光的结合物，导致QDs的荧光猝灭，其猝灭方式属于静态猝灭。

4 结论

本文用巯基乙酸作为稳定剂，合成了水溶性TGA－CdTe QDs。在弱碱环境中，用巯基乙酸做稳定剂修饰的带负电的CdTe QDs与带正电的鲑精蛋白通过静电引力及疏水作用力结合，形成粒径较大的结合物，引起RRS光谱的显著增强和荧光的猝灭。在一定的条件下，RRS光谱的强度与鲑精蛋白的浓度呈现良好的线性关系。本文研究了鲑精蛋白和CdTe QDs相互作用的RRS光谱、适宜的反应条件和影响因素，通过RRS光谱、荧光光谱、紫外吸收光谱，研究了CdTe QDs与鲑精蛋白的相互作用机理，由此建立一种以CdTe QDs作探针共振瑞利散射法快速灵敏检测鲑精蛋白的新方法。

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[3]高 阳，毕绍丹.蛋白质与玫瑰桃红R共振瑞利散射的研究及应用[J].广东微量元素科学，2009，7（16）：21～24.

[4]Deng D W，Yu J S，Pan Y.Water－soluble CdSe and CdSe／CdS nanocrystals：A greenersynthetic route[J].J Colloid Interface Sci，2006，299：225～232.

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[7]张 毅.单质碘对水溶性CdTe量子点的荧光猝灭研究[J].光谱实验室，2009，4（26）：974～978.