导数同步荧光法测定鸭蛋蛋清中金霉素残留含量

袁海超，赵进辉，2，刘木华*，肖海斌，徐 将

(1.江西农业大学 工学院/生物光电及应用重点实验室，江西 南昌 330045;2.华南农业大学 南方农业机械与装备关键技术省部共建教育部重点实验室，广东 广州 510642)

鸭蛋蛋清中残留的抗生素含量的快速测定对评价鸭蛋内部品质有着重要意义。金霉素等四环素类抗生素是残留在鸭蛋中常见的抗生素，人们长期食用含有抗生素的鸭蛋后可能会对人体造成致癌、致畸、致突变、过敏和变态反应、毒性作用、影响人体的激素平衡等危害。目前，鸭蛋中的抗生素的常规测定方法有理化检测方法[1－2]、微生物法[3－4]、酶联免疫分析法[5－6]等，这些方法虽然检测精度较高，但需要进行复杂的前处理，且检测耗时，操作复杂，不能满足鸭蛋中金霉素含量的绿色快速检测要求。因此，有必要探索一种绿色快速的鸭蛋中抗生素检测方法。

导数同步荧光法不仅可以减小背景干扰和谱带重叠，而且更有利于减小散射干扰和光谱重叠现象，是一种高选择性与高灵敏度的混合物分析方法[7－8]。基于荧光光谱的优越性，已有学者对鳗鱼组织中三种喹诺酮药物残留[9]、猪肉中的螺旋霉素[10]与强力霉素[11]残留等进行了研究。但从目前查阅的文献来看，对物体内的抗生素残留主要是先对提取液进行荧光检测，然后建立最佳波长处的荧光强度与抗生素浓度之间的关系。实际上生物组织的多样性和复杂性，有必要对完整的荧光光谱信息进行提取和分析，从中得到有用的荧光光谱特征信息，进而建立预测模型。鉴于此，本研究对完整的荧光光谱信息进行分析与处理，先用联合区间偏最小二乘法(siPLS)优选一阶导数荧光光谱特征子区间，然后用遗传算法(GA)在特征子区间内提取特征波长，在此基础上建立鸭蛋蛋清中金霉素残留的一阶导数荧光光谱的预测模型，尝试建立一种鸭蛋蛋清中金霉素残留含量的绿色快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

鸭蛋(购于江西农业大学市场);盐酸金霉素标准品(纯度约90%，购于中国标准物质网);NaOH为分析纯;水为超纯水。

1.2 仪器设备

Cary Eclipase荧光分光光度计(Varian，Inc.，USA);FA1004B型电子天平(精度为0.1 mg，上海上平仪器有限公司);JK－50B型超声波清洗器(合肥金尼克机械有限公司);HH－6型数显恒温水浴锅(上海浦东物理光学仪器厂);石英比色皿(光程为1 cm)。

1.3 试验方法

(1)在鸭蛋壳上开个小口，让蛋清慢慢流入烧杯中，然后用玻璃棒将蛋清搅拌均匀作为缓冲液备用;(2)称取10.0 mg金霉素标准品，以超纯水稀释定容至100 mL，超声溶解，配制成100 mg/L标准储备液;(3)分别取不同体积金霉素标准溶液于棕色容量瓶中，加入0.1 mol/L NaOH溶液1 mL，在沸水浴中反应45 min后，用鸭蛋蛋清缓冲液稀释定容至刻度，摇匀，得到60个样本，其中48个作为校正样本，12个作为预测样本，样本中的金霉素含量统计结果如表1所示。(4)将不同金霉素含量的样本置入石英比色皿中，利用Cary Eclipase荧光分光光度计分别采集其同步荧光光谱。同步荧光光谱采集参数设置为:波长差△λ为70 nm，PMT探测器电压为700 V，激发和发射狭缝均为2.5 nm，Emission filter参数设置为360～1 100 nm，平滑方式为Moving Average，中等扫描速度，在280～400 nm内同步扫描。

表1 样本中的金霉素含量统计结果Tab.1 Statistical results of aureomycin content of samples

1.4 数据分析

本研究使用MATLAB R2007b进行相关的数据分析。先将同步荧光光谱进行一阶导数处理，然后用siPLS－GA法进行特征波长的提取，最后应用SVM_SteveGunn工具箱建立鸭蛋蛋清中金霉素残留含量的定量测定模型。

2 试验结果与分析

2.1 三维同步荧光指纹图谱

图1 样本的三维同步荧光等高线光谱图Fig.1 Contour spectrum diagram of three-dimensional synchronous fluorescence of samples

按照试验方法，对鸭蛋蛋清(空白样本)、金霉素标准品和含金霉素的鸭蛋蛋清样本进行三维同步荧光光谱扫描，其中波长差△λ 为40，50，60，70，80，90，100，110，120 nm，得到的三维同步荧光等高线光谱图如图1所示。从图1(a)可以看出，在Ex=309.07 nm/△λ=60 nm附近具有一个最佳的鸭蛋蛋清特征荧光峰;从图1b可以看出，在Ex=344 nm/△λ=70 nm附近具有一个最佳的金霉素特征荧光峰;从图1c可以看出，鸭蛋蛋清与金霉素的特征荧光峰的位置分别发生了几个nm偏移，但图1a中的鸭蛋蛋清同步荧光指纹和图1b中的金霉素同步荧光指纹在图1c中得到了较好的重现，且两者的荧光峰得到了较好的分离。因此，根据鸭蛋蛋清与金霉素各自的三维同步荧光指纹特性，可分辨出鸭蛋蛋清与金霉素的波峰及其种类。

2.2 同步荧光波长差△λ的选择

为了选择合适的波长差△λ，测定了含金霉素的鸭蛋蛋清的三维同步荧光光谱，其中波长差△λ为40，50，60，70，80，90，100，110，120 nm，样本的示例图如图2所示。从图2可以看出，随着△λ增加，鸭蛋蛋清背景峰与金霉素的同步荧光强度都是呈先增强后减弱的趋势，鸭蛋蛋清在△λ=60时最强，金霉素在△λ=70 nm时最强。考虑到对金霉素检测的灵敏度，综合分析，本研究选择△λ=70 nm进行后续试验研究。

图2 含有金霉素的鸭蛋蛋清的三维同步荧光光谱图Fig.2 Three-dimensional synchronous fluorescence spectroscopy of duck egg white with aureomycin

2.3 同步荧光光谱的一阶导数预处理

虽然同步荧光光谱能够较好的解决鸭蛋蛋清与金霉素的光谱重叠现象，但是导数技术与同步荧光光谱相结合，能更好地解决背景干扰和谱带重叠问题[8]。因此，本研究采用了Savitizky Golay对同步荧光光谱进行一阶导数预处理，其中:窗口参数为5，拟合次数为2。经过一阶导数预处理后的光谱如图3所示。

2.4 siPLS选择特征光谱区间

含金霉素的鸭蛋蛋清的一阶导数同步荧光的全光谱波长点数为121，若不加筛选而直接用于模型预测，导致的后果可能是不仅会影响模型的预测速度，而且一些无用波长会对模型的预测精度产生不良影响，不利于快速检测。因此，本研究先用siPLS优选一阶导数荧光光谱特征子区间，然后用GA在特征子区间内提取特征波长。试验将整个一阶导数同步荧光光谱分别划分为 10、11、12、13、…、24、25个子区间，通过交互验证法优化被划分的区间数与联合子区间，联合子区间数取值范围为2～4，以考察不同数目的子区间划分与联合子区间数对模型性能以及最佳波长区间的影响。表2为基于siPLS的特征光谱区间选择结果。

依据交互验证均方根误差(RMSECV)选择导数同步荧光的特征光谱区间。由表2可以看出，当整个导数同步荧光光谱区域被划分为23个子区间(前6个子区间每个子区间有6个波长，后17个子区间每个子区间有5个波长)，主成分因子数为10，联合子区间为[5 11 14 16]时，为本研究应用siPLS优选特征光谱区间结果。图3给出了基于siPLS的最佳特征光谱子区间组合，图中黑色条带区表示被选中的4个特征光谱子区间，共21个特征波长，各子区间对应的波长范围分别为:304.0～309.1 nm，336.0～340.0 nm，351.1 ～355.1 nm 和361.1 ～365.1 nm。

图3 基于siPLS选择的最佳特征光谱区间选择结果Fig.3 Results of characteristic spectral regions selected by siPLS

表2 基于siPLS的特征光谱区间选择结果Tab.2 Results of feature spectral regions selected by siPLS method

2.5 GA提取特征波长

在被选中的[5 11 14 16]这4个特征光谱子区间的基础上，继续用GA进行一阶导数同步荧光特征波长提取。此时GA的相关参数设定为:初始群体为30，交叉概率为0.5，变异概率为0.01，以RMSECV值构造GA算法的适应度函数，当迭代100次时本次迭代终止。图4为所有21个变量按选取频率重新排列后，RMSECV值随选取变量数的逐步增加而变化的趋势图。由图4可以看出，最佳的变量数为11时，所对应的RMSECV值最低为1.195 7。因此，这11个变量即为GA法所优选的特征波长。

图4 不同变量数与RMSECV的对应关系图Fig.4 RMSECV as a function of the number of variables included

图5 鸭蛋蛋清中金霉素含量测定中预测值与实测值之间的关系Fig.5 Relationship between actual value and predictive value of aureomycin contents in Duck Egg White

2.6 模型的预测结果与讨论

针对支持向量回归(SVR)在解决非线性问题与小样本统计问题方面的优势[12]，本研究选择采用 SVM_Steve-Gunn工具箱中的Regression_SVM_SteveGunn.m文件来建立SVR预测模型，并以径向基函数作为SVR的核函数。表3给出了不同条件下应用Regression_SVM_SteveGunn.m文件建立模型的预测结果，从表3可以看出，在原始全光谱范围内建立的模型预测效果最差，一阶导数全光谱建立的模型预测效果次之，以siPLS－GA选择波长建立的预测模型效果最好。这说明对原始光谱进行一阶导数处理后较好的解决了背景干扰和谱带重叠等问题，而siPLS－GA法进一步从一阶导数同步荧光光谱中剔除了一些次要波长，有益于提高本研究的预测模型的预测精度和速度。图5给出了以siPLS－GA优选的波长作为输入建立的预测模型的鸭蛋蛋清中金霉素残留含量的预测值与实测值之间的关系，其预测集的决定系数和预测均方根误差分别为0.973和1.501 1 mg/L，能够满足鸭蛋蛋清中金霉素残留含量快速测定要求。

表3 不同条件下的模型的预测结果比较Tab.3 Result and comparison of models in different conditions

3 结论

本研究探讨了利用一阶导数同步荧光光谱结合siPLS、GA、SVR来建立鸭蛋蛋清中金霉素残留含量的绿色快速测定方法。先根据三维同步荧光光谱优选出检测鸭蛋蛋清中的金霉素含量的最佳波长差△λ为70 nm，然后对原始同步荧光光谱进行一阶导数预处理，并用siPLS优选了4个特征光谱子区间，即[5 11 14 16]，在这4个特征光谱子区间内继续用GA优选出11个特征波长，最后用SVM_SteveGunn工具箱建立了基于SVR的预测模型，预测集的决定系数和预测均方根误差分别为0.973和1.501 1 mg/L。研究结果表明，本文研究方法用于鸭蛋蛋清中金霉素残留含量的绿色快速测定是可行的。

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