MMP1，MMP2和TIMP2在雄附方干预大鼠肺间质纤维化中的作用

王 勇，杨永滨，马玉琛

1解放军医学院/解放军总医院 中医研究所，北京 100853；2河北大学基础医学院 病理教研室，河北保定 071000；3解放军第252医院 中医康复科，河北保定 071000

肺间质纤维化属于间质性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)，可造成呼吸衰竭，甚至死亡[1]。肺间质纤维化是上皮细胞损伤和不良修复的结果。目前临床上对肺纤维化的治疗主要是应用糖皮质激素、免疫抑制剂/细胞毒药物和抗纤维化药物联用或单用，但疗效均不佳。经临床实践与动物实验研究均证实传统中药制剂雄附方可有效治疗继发性肺纤维化[2]。本研究在前期研究成果的基础上，通过观察基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)中的MMP1与MMP2和内源性基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs)中的 TIMP2，在雄附方干预博莱霉素诱导的肺间质纤维化大鼠模型肺组织中的表达水平，旨在进一步探讨雄附方预防大鼠肺间质纤维化的作用机制。

材料和方法

1 主要仪器及试剂 光学显微镜及配套图像采集与分析软件(Olympus IX71和imagepro plus6.0)。注射用盐酸博莱霉素(15 mg/支，粉剂)，日本化药株式会社生产，批号870690)，用0.9%氯化钠注射液稀释成浓度为0.5%的博莱霉素注射液。兔抗大鼠MMP1、MMP2和TIMP2多克隆抗体(工作浓度1∶150、1∶150、1∶100 和 1∶100)、即用型 SPTM检测试剂盒和浓缩型DAB显色试剂盒均购自北京博奥森生物技术有限公司。自制雄附方(由雄黄粉0.1 g，制白附子粉1.2 g，僵蚕粉1.2 g组成)。醋酸泼尼松片(5 mg/片，片剂)天津太平洋制药有限公司生产，批号H12020809。

2 实验动物及分组 选择SPF级SD雄性大鼠70只，6周龄，体质量(206±16) g，购自军事医学科学院实验动物中心，许可证号SCXK-(军)2002-001，饲养环境温度(25±1)℃，相对湿度50%~60%。随机分为对照组(BC)，假手术组(PS)，纤维化模型组(MD)，醋酸泼尼松组(PN 5.6 mg/kg)，雄附方高、中、低剂量组(XFFH、XFFM和XFFL 1.4 g/kg、0.7 g/kg、0.35 g/kg)7组，每组10只。

3 肺纤维化大鼠模型制备及给药 对照组以外的实验大鼠均给予腹腔注射1.5%戊巴比妥钠(30 mg/kg)，待大鼠麻醉后将其仰卧位固定在鼠台上，以75%医用酒精常规消毒皮肤、铺巾；取颈部正中线剪开皮肤0.5 cm，以血管钳钝性分离逐层剥离暴露气管，用4号针头从气管软骨环间隙向心端刺入气管，注入0.3 ml博莱霉素氯化钠溶液(7.5 mg/kg)或0.9%氯化钠注射液(假手术组)，再注入0.3 ml空气，立即将动物直立并旋转，使药液在肺内均匀分布。再次消毒后缝合肌肉、皮肤。假手术组除注入气管等量的0.9%氯化钠注射液外，其他步骤相同。造模后第2天用0.9%氯化钠注射液(0.014 L/kg)或相应药物(混悬液0.014 L/kg)每天灌胃(ig)，每周连续给药6 d，休息1 d，共给药4周。给药4周后断头处死，用手术剪和镊子摘取双肺，取部分右中肺组织，4%多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片。

4 检测指标 免疫组织化学染色(SP)法检测肺组织中MMP1、MMP2和TIMP2的表达水平。具体步骤参照相关试剂盒使用说明书。每组染色均设阳性对照(以已知MMP1、MMP2和TIMP2阳性的乳腺癌组织切片)和阴性对照(以0.01 mol/L PBS代替一抗)组切片染色。MMP1、MMP2和TIMP2的染色阳性定位为胞浆内，阳性细胞均呈棕黄色颗粒显示，背景清晰无非特异性着色。本研究采用测量累积光密度(integrated optical density，IOD)值定性评价方法，评估各组肺组织中MMP1、MMP2和TIMP2的阳性表达水平及组间差异。具体操作：选取各组肺组织中每张切片400倍视野中5个有代表性不连续视野，将所选目的区域图像经OlympusIX71光学显微镜及其自带软件imagepro plus6.0采集并测量其IOD值，每组共需测量和记录50个IOD值，取均数后进行组间差异比较。本研究选取OD值越大代表目的蛋白阳性表达水平越高的OD值检测体系。

5 统计学处理 所得数据结果以-x±s表示，采用SPSS16.0 for windows软件包中单因素方差分析(oneway ANOVA)法进行多组间比较及两两比较，a=0.05。

结 果

1 MMP1的表达 MMP1以细胞浆呈棕黄色颗粒者为阳性细胞，背景清晰无非特异性着色。阳性细胞包括肺泡上皮细胞、间质成纤维细胞和部分炎细胞。比较MMP1在各组中的IOD值可以发现，MMP1在MD组阳性表达水平最高(455.16±39.08)；PN、XFFM和XFFL组MMP1的阳性表达强度均高于BC、PS和XFFH组(F=264.715，P＜0.05)；其中XFFH组表达水平最低(20.11±11.94)。见图1、表1。

2 MMP2的表达 MMP2的阳性部位在肺泡上皮细胞、间质成纤维细胞和部分炎细胞的细胞浆。其蛋白表达水平在MD组阳性表达为各组之最(253.24±48.72)；PN、XFFM 和 XFFL组 MMP2的阳性表达强度均高于BC、PS和XFFH组(P＜0.01)，且差异均有统计学意义(F=168.58，P＜0.05)。其中XFFH组表达水平最低(33.59±17.32)。见图1、表1。

3 TIMP2的表达 在肺泡上皮细胞、间质成纤维细胞和部分炎细胞的细胞浆中可见TIMP2呈阳性染色。MD组TIMP2蛋白阳性表达水平最高 (458.96±67.87)；PN、XFFM 和 XFFL 组 MMP1、MMP2和TIMP2的阳性表达强度均高于BC、PS和XFFH组，且差异均有统计学意义(F=217.48，P＜0.05)。其中BC组表达水平最低(21.37±15.47)。见图1、表1。

讨 论

现代医学认为肺间质纤维化是多种原因引起的成纤维细胞增殖、MMPs/TIMPs系统平衡被破坏，大量细胞外基质聚集；发生过程与受损肺组织发生实质细胞变性坏死，局部炎细胞浸润，氧自由基含量增加，间质支撑结构中的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分早期被分解破坏，炎症后期增生修复中局部新生成ECM在肺间质的沉积过多等因素和环节影响有关[3]。细胞外基质的含量变化与分泌ECM主要成分(如胶原纤维)的肌成纤维细胞数量增加相关，也与受损组织中蛋白水解酶的含量和活性有关。基质金属蛋白酶(MMPs)基因激活后可直接降解基底膜和ECM。MMPs与特异性抑制剂TIMPs 特异性结合之后失活，含量比例平衡直接参与和影响ECM的代谢[4-5]。MMPs与特异性抑制剂TIMPs含量比例平衡，决定着ECM是否过量沉积于肺。

图1 MMP1、MMP2和TIMP2在雄附方对抗博莱霉素诱导大鼠肺纤维化肺组织中的阳性表达(IHC染色，×400)MMP1： 1a: 正常对照组； 1b: 模型组； 1c: 醋酸泼尼松组； 1d: 雄附方高剂量组； MMP2： 2a: 正常对照组； 2b: 模型组； 2c: 醋酸泼尼松组； 2d: 雄附方高剂量组； TMMP2： 3a: 正常对照组； 3b: 模型组； 3c: 醋酸泼尼松组； 3d: 雄附方高剂量组Fig.1 Expressions of MMP1, MMP2 and TIMP2 in the lung tissue after treatment of bleomycin-induced pulmonary fibrosis with Xiongfufang(IHC staining, ×400)1a: MMP1 in NB; 1b: MMP2 in MD; 1c: MMP2 in PN; 1d: MMP2 in XFFH; 2a: MMP2 in NB； 2b: MMP2 in MD； 2c: MMP2 in PN;2d: MMP2 in XFFH; 3a: MMP2 in NB； 3b: MMP2 in MD； 3c: MMP2 in PN； 3d: MMP2 in XFFH

表1 雄附方对抗博莱霉素诱导大鼠肺纤维化4周时各组肺组织中MMP1，MMP2和TIMP2的表达Tab.1 Expression of MMP1, MMP2 and TIMP2 in different groups 4 weeks after treatment of bleomycininduced pulmonary fibrosis with Xiongfufang

研究结果显示：造模4周后，MD组肺组织中MMP1、MMP2和TIMP2活性表达水平上升，肺组织纤维化程度重；发生机制可能是肺组织受损后，通过机体代偿增多MMP1来降解ECM中的胶原纤维，增多MMP2降解明胶，局部TIMP2蛋白表达水平代偿性升高，但不足以平衡MMP1、MMP2活性比例。雄附方高剂量组肺组织中的MMP1和MMP2表达水平明显低于纤维化模型组和其他用药组，TIMP2表达水平明显高于对照组和假手术组；MMP1和MMP2在损伤后期表达呈下调趋势可能与雄附方上调局部TIMP2的表达，造成晚期MMPs/TIMPs比值下降等因素有关；造成了局部受损组织在损伤后重建过程中ECM沉积减少，组织纤维化程度不明显。TIMP2高表达的机制尚不清楚，可能与用药前博来霉素造成早期局部肺泡上皮损伤，基底膜部分暴露后刺激MMPs表达水平上升等生物效应有关。醋酸泼尼松组肺组织中的MMP1和MMP2表达水平明显低于肺纤维化模型组，但与对照组和假手术组比较明显增高，差异存在统计学意义；与高剂量雄附方组比较，二者差异也有统计学意义。雄附方中、低剂量组肺组织中的MMP1、MMP2和TIMP2表达水平与醋酸泼尼松组相近，说明高剂量是干预肺间质纤维化形成的最佳剂量，为临床用药提供了依据。综上所述，推测雄附方对抗肺组织纤维化机制可能与其有效平衡肺组织中MMP1、MMP2和TIMP2的表达水平有关。

1 King TE Jr， Pardo A， Selman M. Idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Lancet， 2011， 378（9807）：1949-1961.

2 马玉琛，杨永滨，王勇，等．雄附散阻抗大鼠肺间质纤维化的病理形态观察［J］.武警医学，2010，21（2）：131-134．

3 Yang K， Palm J， König J， et al. Matrix-Metallo-Proteinases and their tissue inhibitors in radiation-induced lung injury［J］. Int J Radiat Biol， 2007， 83（10）：665-676.

4 Wynn TA. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis［J］. J Pathol， 2008， 214（2）：199-210.

5 Oggionni T， Morbini P， Inghilleri S， et al. Time course of matrix metalloproteases and tissue inhibitors in bleomycin-induced pulmonary fibrosis［J］. Eur J Histochem， 2006， 50（4）：317-325.