刺五加叶片的透射电镜观察

张红梅 王明艳 韩秀玲 吴 鹏 龙月红 邢朝斌

(河北联合大学生命科学学院，②文法学院 河北唐山 063000;①中国人民大学附属中学朝阳学校)

刺五加(Eleutherococcus senticosus Harms)是我国医药珍品，根、茎、叶均可入药。自70年代末以来以刺五加为原料生产的各种片剂、冲剂、针剂和刺五加参茶等产品远销国外，因而使刺五加资源消耗与日俱增[1，2]。经过几十年掠夺式的采挖，严重地破坏了野生刺五加资源;在自然状态下刺五加有性繁殖能力差[3]，无性繁殖困难[2]，1992 年出版的《中国植物红皮书》已把刺五加列为了渐危物种。

利用超薄切片进行透射电镜观察，能获得分辨率高、内容丰富的植物细胞信息，使其成为植物细胞结构研究的重要工具。但植物的细胞壁厚、结构密集、药物渗透较慢，加之操作步骤繁琐，致使制备难度加大[4]。因此，鲜见药用植物的相关报道。本文采用透射电镜观察刺五加叶的细胞结构特征，为深入研究细胞的组织结构和药材的鉴别提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 以吉林省伊通满族自治县3年生野生刺五加的叶片为供试材料，并经作者鉴定。

1.2 方法 ①取材:取无病虫危害、无其它污染的刺五加叶片，用清水洗净后剪成0.5cm×1cm大小，作为样品;②戊二醛固定:将样品立即放入2.5%戊二醛固定液中，使叶片充分浸没，固定时间24h;③冲洗:吸除固定液，用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.2)冲洗3次，每次15min;④锇酸固定:去除磷酸缓冲液，浸入在1%锇酸中固定1h后，重蒸水洗涤3次，每次15min;⑤脱水:经体积分数为30%、50%、70%(过夜)、90%、100%的乙醇逐级脱水，每次15min。去除乙醇，加入100%乙醇:100%丙酮(1:1)、100%丙酮处理，每次15min。样品在70%乙醇脱水之前，实验均是在0～4℃下进行，样品进入90%乙醇脱水时在室温下进行。⑥包埋:用环氧丙烷:包埋剂(1:1)渗透45min后，用812树脂包埋剂进行包埋，分别在37℃中聚合12h，60℃中聚合24h，即可取出待用。⑦切片与染色:将上述样品进行修样切片，最后经乙酸双氧铀和柠檬酸铅双染10min;⑧观察:在日立H－7650透射电子显微镜下观察、照相。

2 结果

幼嫩叶片叶肉细胞排列紧密、整齐，细胞核较大，居于细胞中央。相邻细胞间有胞间连丝相连，见图1。细胞质中含有叶绿体、线粒体、内质网、高尔基复合体及淀粉粒等细胞器，液泡小，见图 1、2。

图1 细胞间的胞间连丝(×15000)

图2 叶肉细胞中的细胞器(×20000)

叶片成熟后细胞体积变大，核较小，且被液泡挤压到细胞的边角处，各种细胞器数量变少，仅有叶绿体和淀粉粒等被挤压到细胞边缘，每个叶肉细胞中约有叶绿体5～10个，沿细胞周围分布，呈椭圆状，见图3。

图3 叶肉细胞中的叶绿体(×2000)

图4 叶绿体解体过程(×25 000)

透射电镜下的叶绿体均呈卵圆形，或椭圆形，平均长轴长为:7.72μm，短轴长为:3.91μm，基粒片层排列整齐紧密、结构清晰，部分轻微膨胀，基粒片层有8～20层，与基质片层界限清晰，叶绿体中散布有体积较小的淀粉粒;叶肉细胞中的部分叶绿体膜内陷，膜上具小孔，少量叶绿体膜破裂，叶绿体解体(图4箭头所示)。叶肉细胞的中央有1个大液泡，液泡体积大，约占成熟细胞总体积的4/5，液泡膜完整，充实，与外围存在的细胞质紧密相连，见图4。液泡中有絮状物和体积大的囊泡，把液泡划成几部分，其内还发现有多层膜绕成的不定形团，见图5。叶肉细胞中线粒体结构完整，多呈较规则的圆球形或椭圆形，双层膜、内嵴清晰可见，呈随机排列。细胞核多为圆球形或不规则形，双层膜、核孔结构清晰、完整，内部染色质均匀分布，见图1、2。

图5 适应生长环境形成的液泡(×30 000)

字母缩写说明:

CW(cell wall):细胞壁;P(plasmodesma):胞间连丝;M(mitochondrion):线粒体;CH(chloroplast):叶绿体;ST(stroma thylakoid):基质类囊体;GT(granum thylakoid):基粒类囊体;SG(starch grin):淀粉粒;N(nucleus):细胞核;NM(nucleus membrane):核膜;NH(nuclear hole):核孔;ER(endoplasmic reticulum):内质网;G(golgi complex):高尔基体;V(vacuole):液泡

3 讨论

一般情况下，植物样品用锇酸进行固定时，时间延长可提高固定效果，但植物的种类较多，性能区别较大，在固定时须区别对待，对于迅速发黑的植物样品，用锇酸固定时不宜超过2 h，否则会造成样品发脆，难以操作，甚至破坏掉已保存的结构[4]。刺五加叶肉组织中具有较大的液泡，在溶液中叶片难以下沉，是较难固定的植物透射电镜样品。加之，细胞壁结构坚硬，药物难以渗透，其样品制备更加困难。若采用常规制备方法，则会出现叶片内部结构不清晰、切片有颠痕和开裂等不良现象，不能进行大视野的结构观察和摄影。笔者采用锇酸固定1h，减少树脂渗透浓度的方法制备出的刺五加叶片样品，整体信息丰富，结构保存良好，没有出现不良现象。812树脂是制备植物样品的良好材料，但一旦受潮发软，切片上会出现褶皱，影响观察。因此，要在干燥的环境中进行树脂的相关操作。

透射电镜下观察发现，部分叶片样品中，液泡膜出现内陷，形成细胞质突起和细胞质带，有时形成多层的膜状结构，见图5。我们认为这是刺五加长期生长于寒冷气候条件下，为防止细胞结冰形成的与环境相适应的结构，是对环境高度适应性的反应。因为液泡膜内陷的同时，大量细胞质，乃至某些细胞器也常常被吞噬到液泡中，膜层结构和吞噬物经液泡中多种酶的溶解，提高了液泡中溶质浓度，由于液泡中溶质浓度的提高，降低了液泡中的水分向细胞质渗透的速度，避免了溶质浓度过度稀释而引起结冰，同时也减少了细胞单位体积内结冰的水含量[5]。

[1] 祝 宁，卓丽环，臧润国.刺五加(Eleutherococcus sentincosus)会成为濒危种吗? [J].生物多样性，1998，6(4):253

[2] 邢朝斌，沈海龙，赵丽娜，等.刺五加的体细胞胚胎发生研究[J].中草药，2006，25(5):769

[3] 邢朝斌，沈海龙，黄 剑，等.不同温度、时间层积处理对刺五加种子发芽的影响[J].辽宁林业科技，2006，9(5):9

[4] 徐柏森，张耀丽，何开跃，等.植物透射电镜样品制备技术探讨[J].中国野生植物资源，2006，25(3):41

[5] 李 琪，王 双.沙冬青叶肉细胞中液泡膜内陷特征的电镜观察[J].电子显微学报，1993，12(1):101