UPLC 法测定儿童血浆中维生素A

张 桢，杨跃煌，孙帮燕

1.昆明市儿童医院检验科/昆明医科大学附属儿童医院中心实验室，云南 昆明 650028 2.大理学院药学院，云南 大理 671000

脂溶性维生素A是人类机体维持正常代谢和机能的必需物质，对儿童骨骼、视力发育、粘膜生长和生殖功能影响尤为重要，测定儿童血浆中脂溶性维生素A的浓度，不仅可以了解脂溶性维生素A营养状况，而且可以为合理补充脂溶性维生素 A提供依据［1－5］。

1 仪器及试剂

Waters－ACQUITY－UPLC超高效液相色谱仪(Waters，美国)，Empower数据处理系统，Sar－torius BT125D电子天平(德国赛多利斯仪器系统有限公司)，MULTIFUGE X1R超高速离心机(Thermo，美国)，XW－80A涡旋混合器(上海医科大学仪器厂)。

对照品(中国药品生物制品检定所，批号:100138－200603);甲醇:色谱纯(美国Fisher公司);水:自制超纯水，水机(PURELAB ELGA公司，英国)。

2 色谱条件 色谱条件:色谱柱为BEH C18柱(50 mm×2.1

3 样品测定

3.1 储备液的配制 取Vitamin A对照品约5mg，精密称定，置50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得浓度约为1000 mg·L－1的储备液。

3.2 血样预处理:取血浆200μl，加入140μl甲醇和异丙醇(v/v，8:2)，涡旋30s后，加入1000ul正已烷，涡旋1min，室温高速离心2min(12000×g)，取上清液700μl，吹干后甲醇 100 μl复溶。

4 线性关系和线性范围

取空白血浆200μl共6份，分别加入不同浓度Vitamin A 50μl，配成浓度为 50，100，200，400，800，1000μg/L 溶液，按“3.2血样预处理”操作，以浓度与峰面积作线性回归，得标准曲线方程。y=3739.5x+3073.5，R2=0.9996，线线性范围为50～1000μg/L。

5 方法专属性

按“3.2血样预处理”处理方法和色谱条件，不受血浆中内源性杂质的干扰，见图1－2.

图1 标准品维生素A经“3.2”处理后浓度为400μg/L色谱图(保留时间为2.098)

图2 正常儿童血浆加标准品维生素A经“3.2”处理后浓度为500μg/L－1色谱图(保留时间为2.098)

6 回收率实验

标本加入0.5～2倍标准品后，按3.2处理，计算回收率，结果见表1。

表1 回收率统计表

7 稳定性实验

7.1 储备液稳定性考察，取储备液分别在1，3，5，7天，配制标准使用液80，400，700μg/L直接进样测定，峰面积RSD分别为1.1，1.72，2.7%，表明储备液至少在7天稳定。

7.2 样稳定性考察 用正常儿童血浆进行精密度试验，由回归方程计算实际浓度，日内与日间精密度最大值分别为2.1，5.1%。

8 临床应用 检测了300例正常儿童血浆，维生素A浓度于临床相符，测定值在300～802μg/L之间。

9 讨论

利用维生素A分子中具有共轭多烯醇的侧链结构，在325～328nm的范围内有紫外最大吸收，用于含量测定［7］。样品处理方法简便与快速:经液液萃取后经氮气蒸发，能满足临床快速测定儿童血浆中维生素A含量需求。

［1］李发美.医药高效液相色谱技术［M］.北京:人民卫生出版社，1999:243－244.

［2］Kamisha L.Johnson－Davis，Steve J.Moore，William E.Owen，Jeaneah M.Cutler，ElizabethL.Frank .A rapid HPLC methodused to establish pediatric reference intervals for vitamins A and E［J］.Clinica Chimica Acta，2009，405:35－38

［3］侯晓清.HPLC法同时测定人中血清维生素A和维生素E［J］.中国药学杂志，1997，3(1):28－31.

［4］J.M.Mata－Granados，M.D.Luque de Castro，J.M.Quesada.Fully automated method for the determination of 24，25(OH)2and 25(OH)D3 hydroxyvitamins，and Vitamins A and E in human serum by HPLC［J］.Journal of PharmaceuticaLAnd BiomedicaLAnalysis，2004，35:575 –582.

［5］M.R.Brunetto，M.A.Obando，M.Gallignani，O.M.Alarcón，E.Nieto，R.Salinas，J.L.Burguera，M.Burguera.HPLC determination of Vitamin D3 and its metabolite in human plasma with on－line sample clean up［J］.Talanta，2004，64:1364 –1370.

［6］国家药典委员会编.中华人民共和国药典(2010年版二部)［M］.北京:化学工业出版社，2010.

［7］刘文英.药物分析［M］.北京:人民卫生出版社，2008:245.