于 游,张才全
(重庆医科大学附属第一医院普外科 400016)
Id蛋白[1]又称为分化抑制因子(inhibitor of differentiation,Id),是新的准原癌基因[2],在多种肿瘤中有异常的表达,参与了肿瘤细胞增殖、凋亡、浸润、迁移以及肿瘤血管生成等多方面相关行为的调控[3-8]。Id1在结肠癌组织中表达明显高于正常组织及结肠癌旁组织[9],故研究Id1与结肠癌的关系,对于进一步阐明结肠癌的生物学行为以及治疗将会有积极意义。本研究在体外过表达及抑表达Id1情况下检测结肠癌HT-29细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)mRNA和蛋白的表达情况以及肿瘤细胞增殖情况,以探讨Id1在结肠癌细胞增殖中的作用。
1.1 试剂 Id1一抗购于Miliipore公司;山羊抗兔二抗购于北京中杉生物有限公司;RNA提取试剂盒购于Takara公司;RT-PCR试剂盒购自Tiangen公司;Trisbase购于上海生工生物工程有限公司;EXTaq酶购于Takara公司;dNTP购于Takara公司;VEGF一抗购于 Miliipore公司;脂质体ipofect amine 2000购于Invitrogen公司;Id1基因的特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)Si-Id-1-001(19bp)[10]由广州锐博生物公司设计与合成,各自的正义和反义序列分别为:正义链5′-UGA GCA AGG UGG AGA UUC U dTdT-3′,反义链3′-dTdT ACU CGU UCC ACC UCU AAG A-5′。
1.2 细胞培养与Id1过表达及抑表达质粒构建及转染 人结肠癌细胞(human colon cancer cells,HT-29)株由中科院上海细胞库提供;HT-29经复苏后,常规培养于含10%新生小牛血清,青霉素(100U/mL),链霉素(100μg/mL)的1640培养基中。Id1全长基因扩增Id1:上游引物:5′-TAA CTG TTC CAT TTT CCG TA-3′,下游引物:5′-TTA CCA CCA TCT AAA TTA TTT G-3′,扩增长度:975bp,退火温度:60℃,采用 Pfu保真酶扩增。PCR扩增Id1片段,利用限制性内切酶EcoR I和NotI将其连接至载体pGEx-4T-1,将连接产物转化大肠杆菌,挑取单菌落,提取质粒,经PCR和双酶切鉴定后测序。转染前1d,将2.5×105个细胞/孔接种于6孔培养板。过表达分为3组:空白组:仅加培养血清;对照组:空载体,转染无义序列;过表达组:转染Id1过表达质粒。抑表达分为3组:空白组:仅加培养血清;对照组:空载体,转染无义序列;抑表达组:转染Id1-siRNA。各组均在37℃,1%O2,99%N2,5%CO2恒温培养箱培养12h后进行转染,实验参照Lipofect amine 2000产品说明书进行操作。待细胞转染48h后,分别用TRlzol和RIPA裂解液提取细胞总RNA和细胞总蛋白。
1.3 RT-PCR检测VEGF mRNA 参照Trlzo试剂盒说明书提取各组细胞总的 RNA。VEGF上游引物:5′-GGG CAG AAT CAT CAC GAA GT-3′,下游引物:5′-GAT GTA CTC GAT CTC ATC AGG GT-3′,扩增长度:117bp,退火温度:60℃。反应体系:1×PCR Buffer,dNTP 0.2mmol/L,cDNA 模板200ng,引物浓度0.4μmol/L,Taq酶1.25U,反应总体积25μL。按照RT-PCR试剂盒进行PCR扩增:1μL DNA样本作为PCR扩增模板,阴性对照扩增模板为去离子水;扩增条件为95℃预变性2min;随后95℃10s,退火温度15s,72℃ 延伸45s,共40个循环;最后72℃延伸10min。实验重复3次,取其平均值。
1.4 Western检测Id1、VEGF蛋白 用RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白后,用Western检测Id1、VEGF蛋白。每106个细胞加入500L细胞裂解液,冰上放置30min裂解细胞,12 000r/min离心20min,收集上清液,测定提取的总蛋白浓度。取等量蛋白样品50g进行8%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。然后将蛋白转移至PVDF膜上,经5%脱脂奶粉封闭,分别与Id1、VEGF多克隆抗体(浓度为1∶1 500)4℃反应过夜及相应的羊抗兔二抗(浓度为1∶3 000)反应,加入化学发光剂ECL反应,显色,密度扫描分析。实验重复3次,取其平均值。
1.5 MTT实验 取各组对数生长期的HT-29细胞,以每孔103接种于96孔板内,加入条件培养基。在第1~8天,每天每种条件培养基的细胞各取出3孔加入 MTT溶液(5g/L)20 μL,继续37℃孵育4h后,吸弃培养上清液,加入DMSO 150 μL,振荡10min。在ELISA检测仪上测定各孔的A490nm值。以时间为横坐标,3复孔的平均光吸收值为纵坐标,绘制HT-29细胞生长曲线。
1.6 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件进行统计学处理,计量资料以表示,组间比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
两组Id1过表达与抑表达VEFG mRNA和VEGF蛋白的结果见表1及图1。干扰后两组MTT结果见图2~3。
图1 Id1对VEGF蛋白的表达电泳图
表1 Id1过表达与抑表达VEGF mRNA和VEGF蛋白表达结果比较
表1 Id1过表达与抑表达VEGF mRNA和VEGF蛋白表达结果比较
▲:P<0.05,与各自对照组比较。
组别蛋白空白组 0.002 99±0.000 69 0.132 00±0.035 10 0.006 16±0过表达VEGF mRNA VEGF 蛋白抑表达VEGF mRNA VEGF.000 83 0.450 00±0.039 30对照组 0.003 49±0.001 34 0.131 00±0.053 00 0.006 26±0.000 45 0.464 00±0.023 10过表达组 0.031 30±0.006 05▲ 0.245 00±0.032 60▲ 0.002 30±0.000 31▲ 0.231 00±0.027 30▲
图2 过表达3组生长曲线
图3 抑表达3组生长曲线
结肠癌发生不仅是癌细胞不断增殖的过程,也是癌细胞分化不断抑制的过程,结肠癌细胞的恶性程度与分化程度密切相关。细胞的分化程度提示肿瘤的良、恶性,并直接影响其预后。Id1负性调节转录因子的活性,抑制细胞分化,从而促进细胞增殖[11]。目前确定在20多种人类肿瘤中均有Id1过表达,提示Id1在肿瘤的发生过程中可能起重要作用,可将其作为这些肿瘤的一个新标志物[12]。敲除Id1基因的荷瘤小鼠身上发现肿瘤不能生长和转移,显示出广泛坏死和少血管,血管缺乏分枝出芽。在胰腺肿瘤组织中,Idl的表达水平越高,肿瘤中的血管密度指数也就越高,都提示Idl的表达和肿瘤的血管发生密切相关[13]。对前列腺肿瘤进行的研究也发现同类现象[14]。在消化系统的肿瘤中,Id1在结肠癌、胰腺癌中的表达也异常增高,Id1蛋白在结肠黏膜的正常组织中没有表达,而在结肠癌组织中的表达明显高于正常组织及癌旁组织。这些均提示Idl蛋白在肿瘤新生血管形成中可能起重要作用。在4个已发现的Id分子中,Id1在肿瘤中的异常表达更为普遍。但Id1蛋白与其他蛋白相互作用机制及调控Id1基因表达上游因子和Id1蛋白的下游效应因子还不清楚。
本研究显示,上调Id1表达后,结肠癌HT-29细胞VEGF mRNA及蛋白均显著提高,这种提高出现在转录水平上,同时肿瘤细胞增殖明显加快;下调Id1表达后HT-29细胞VEGF mRNA及蛋白均显著降低,也出现在转录水平上,而肿瘤细胞增殖明显减慢。以上结果证实了在结肠癌HT-29细胞中Id1通过下游因子VEGF来产生新生血管网,从而影响肿瘤细胞的增殖。
本研究证实,在结肠癌HT-29细胞中Id1为VEGF的上游因子,其在结肠癌细胞增殖中发挥重要作用,Id1有望成为结肠癌治疗的一个新靶点[15]。但Id1通过何种信号途径来调控VEGF,以及调控Id1基因的上游因子有待今后实验中进一步明确。
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