分化抑制因子1对结肠癌HT－29细胞增殖的影响

于 游，张才全

（重庆医科大学附属第一医院普外科 400016）

Id蛋白［1］又称为分化抑制因子（inhibitor of differentiation，Id），是新的准原癌基因［2］，在多种肿瘤中有异常的表达，参与了肿瘤细胞增殖、凋亡、浸润、迁移以及肿瘤血管生成等多方面相关行为的调控［3－8］。Id1在结肠癌组织中表达明显高于正常组织及结肠癌旁组织［9］，故研究Id1与结肠癌的关系，对于进一步阐明结肠癌的生物学行为以及治疗将会有积极意义。本研究在体外过表达及抑表达Id1情况下检测结肠癌HT－29细胞血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA和蛋白的表达情况以及肿瘤细胞增殖情况，以探讨Id1在结肠癌细胞增殖中的作用。

1 材料与方法

1.1 试剂 Id1一抗购于Miliipore公司；山羊抗兔二抗购于北京中杉生物有限公司；RNA提取试剂盒购于Takara公司；RT－PCR试剂盒购自Tiangen公司；Trisbase购于上海生工生物工程有限公司；EXTaq酶购于Takara公司；dNTP购于Takara公司；VEGF一抗购于 Miliipore公司；脂质体ipofect amine 2000购于Invitrogen公司；Id1基因的特异性小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）Si－Id－1－001（19bp）［10］由广州锐博生物公司设计与合成，各自的正义和反义序列分别为：正义链5′－UGA GCA AGG UGG AGA UUC U dTdT－3′，反义链3′－dTdT ACU CGU UCC ACC UCU AAG A－5′。

1.2 细胞培养与Id1过表达及抑表达质粒构建及转染 人结肠癌细胞（human colon cancer cells，HT－29）株由中科院上海细胞库提供；HT－29经复苏后，常规培养于含10%新生小牛血清，青霉素（100U／mL），链霉素（100μg／mL）的1640培养基中。Id1全长基因扩增Id1：上游引物：5′－TAA CTG TTC CAT TTT CCG TA－3′，下游引物：5′－TTA CCA CCA TCT AAA TTA TTT G－3′，扩增长度：975bp，退火温度：60℃，采用 Pfu保真酶扩增。PCR扩增Id1片段，利用限制性内切酶EcoR I和NotI将其连接至载体pGEx－4T－1，将连接产物转化大肠杆菌，挑取单菌落，提取质粒，经PCR和双酶切鉴定后测序。转染前1d，将2.5×105个细胞／孔接种于6孔培养板。过表达分为3组：空白组：仅加培养血清；对照组：空载体，转染无义序列；过表达组：转染Id1过表达质粒。抑表达分为3组：空白组：仅加培养血清；对照组：空载体，转染无义序列；抑表达组：转染Id1－siRNA。各组均在37℃，1%O2，99%N2，5%CO2恒温培养箱培养12h后进行转染，实验参照Lipofect amine 2000产品说明书进行操作。待细胞转染48h后，分别用TRlzol和RIPA裂解液提取细胞总RNA和细胞总蛋白。

1.3 RT－PCR检测VEGF mRNA 参照Trlzo试剂盒说明书提取各组细胞总的 RNA。VEGF上游引物：5′－GGG CAG AAT CAT CAC GAA GT－3′，下游引物：5′－GAT GTA CTC GAT CTC ATC AGG GT－3′，扩增长度：117bp，退火温度：60℃。反应体系：1×PCR Buffer，dNTP 0.2mmol／L，cDNA 模板200ng，引物浓度0.4μmol／L，Taq酶1.25U，反应总体积25μL。按照RT－PCR试剂盒进行PCR扩增：1μL DNA样本作为PCR扩增模板，阴性对照扩增模板为去离子水；扩增条件为95℃预变性2min；随后95℃10s，退火温度15s，72℃ 延伸45s，共40个循环；最后72℃延伸10min。实验重复3次，取其平均值。

1.4 Western检测Id1、VEGF蛋白 用RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白后，用Western检测Id1、VEGF蛋白。每106个细胞加入500L细胞裂解液，冰上放置30min裂解细胞，12 000r／min离心20min，收集上清液，测定提取的总蛋白浓度。取等量蛋白样品50g进行8%十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳。然后将蛋白转移至PVDF膜上，经5%脱脂奶粉封闭，分别与Id1、VEGF多克隆抗体（浓度为1∶1 500）4℃反应过夜及相应的羊抗兔二抗（浓度为1∶3 000）反应，加入化学发光剂ECL反应，显色，密度扫描分析。实验重复3次，取其平均值。

1.5 MTT实验 取各组对数生长期的HT－29细胞，以每孔103接种于96孔板内，加入条件培养基。在第1～8天，每天每种条件培养基的细胞各取出3孔加入 MTT溶液（5g／L）20 μL，继续37℃孵育4h后，吸弃培养上清液，加入DMSO 150 μL，振荡10min。在ELISA检测仪上测定各孔的A490nm值。以时间为横坐标，3复孔的平均光吸收值为纵坐标，绘制HT－29细胞生长曲线。

1.6 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，计量资料以表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

两组Id1过表达与抑表达VEFG mRNA和VEGF蛋白的结果见表1及图1。干扰后两组MTT结果见图2～3。

图1 Id1对VEGF蛋白的表达电泳图

表1 Id1过表达与抑表达VEGF mRNA和VEGF蛋白表达结果比较

表1 Id1过表达与抑表达VEGF mRNA和VEGF蛋白表达结果比较

▲：P＜0.05，与各自对照组比较。

组别蛋白空白组 0.002 99±0.000 69 0.132 00±0.035 10 0.006 16±0过表达VEGF mRNA VEGF 蛋白抑表达VEGF mRNA VEGF.000 83 0.450 00±0.039 30对照组 0.003 49±0.001 34 0.131 00±0.053 00 0.006 26±0.000 45 0.464 00±0.023 10过表达组 0.031 30±0.006 05▲ 0.245 00±0.032 60▲ 0.002 30±0.000 31▲ 0.231 00±0.027 30▲

图2 过表达3组生长曲线

图3 抑表达3组生长曲线

3 讨 论

结肠癌发生不仅是癌细胞不断增殖的过程，也是癌细胞分化不断抑制的过程，结肠癌细胞的恶性程度与分化程度密切相关。细胞的分化程度提示肿瘤的良、恶性，并直接影响其预后。Id1负性调节转录因子的活性，抑制细胞分化，从而促进细胞增殖［11］。目前确定在20多种人类肿瘤中均有Id1过表达，提示Id1在肿瘤的发生过程中可能起重要作用，可将其作为这些肿瘤的一个新标志物［12］。敲除Id1基因的荷瘤小鼠身上发现肿瘤不能生长和转移，显示出广泛坏死和少血管，血管缺乏分枝出芽。在胰腺肿瘤组织中，Idl的表达水平越高，肿瘤中的血管密度指数也就越高，都提示Idl的表达和肿瘤的血管发生密切相关［13］。对前列腺肿瘤进行的研究也发现同类现象［14］。在消化系统的肿瘤中，Id1在结肠癌、胰腺癌中的表达也异常增高，Id1蛋白在结肠黏膜的正常组织中没有表达，而在结肠癌组织中的表达明显高于正常组织及癌旁组织。这些均提示Idl蛋白在肿瘤新生血管形成中可能起重要作用。在4个已发现的Id分子中，Id1在肿瘤中的异常表达更为普遍。但Id1蛋白与其他蛋白相互作用机制及调控Id1基因表达上游因子和Id1蛋白的下游效应因子还不清楚。

本研究显示，上调Id1表达后，结肠癌HT－29细胞VEGF mRNA及蛋白均显著提高，这种提高出现在转录水平上，同时肿瘤细胞增殖明显加快；下调Id1表达后HT－29细胞VEGF mRNA及蛋白均显著降低，也出现在转录水平上，而肿瘤细胞增殖明显减慢。以上结果证实了在结肠癌HT－29细胞中Id1通过下游因子VEGF来产生新生血管网，从而影响肿瘤细胞的增殖。

本研究证实，在结肠癌HT－29细胞中Id1为VEGF的上游因子，其在结肠癌细胞增殖中发挥重要作用，Id1有望成为结肠癌治疗的一个新靶点［15］。但Id1通过何种信号途径来调控VEGF，以及调控Id1基因的上游因子有待今后实验中进一步明确。

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