丁酸钠通过下调细胞干扰素调节因子－1抑制鼻咽癌细胞CNE2吲哚胺－吡咯2，3－双加氧酶的表达＊

郭芝刚，曾 军，张锦宏，何玉文△

（广州医学院：1.基础学院；2.第一附属医院药剂科 510120）

研究表明，吲哚胺－吡咯2，3－双加氧酶（indoleamine－pyrrole 2，3－dioxygenase，IDO）在肿瘤逃避免疫监视、肿瘤发生、发展中起着重要作用［1－2］。多种人肿瘤细胞和原发性肿瘤组织表达IDO，其抑制抗原特异性T淋巴细胞的增生，使肿瘤逃避机体的免疫攻击［3－4］。研究发现，抑制IDO表达可以抑制自发性肿瘤的生长［5］，丁酸钠（sodium butyrate，NaB）也能抑制IDO的表达，但机制不明确。本研究主要探讨NaB抑制鼻咽癌细胞CNE2内IDO表达的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 CNE2细胞株为人鼻咽癌上皮细胞，由中山大学肿瘤医院基础部赠送。

1.1.2 试剂 试剂Soudim butyrade，购自Sigma公司；注射用重组人干扰素γ（IFN－γ），海雷泰，国药准字S19990059；兔抗IDO抗体（中山大学微生物与生化制药研究室制作）；β－肌动蛋白抗体（β－actin）购自北京博奥森生物技术有限公司；辣根过氧化物酶（HPR）标记的羊抗兔IgG购自Promega公司；SYBR Green PCR检测试剂盒购自Toyobo公司；RPMI－1640培养基粉末购自美国Gibco公司；新生牛血清购自北京晨曦勇创公司。

1.2 细胞培养 CNE2细胞用含10%新生牛血清的RPMI－1640培养基，37℃，5%CO2条件下培养，以每孔3×105个接种6孔板，待细胞覆盖率达60%～70%，加入NaB和（或）IFN－γ处理细胞。

1.3 Western blot免疫印迹检测IDO的表达 取上述培养的细胞，加入2mmol／L NaB处理CNE2细胞0、6、12、24h后，加入100U／mL IFN－γ刺激24h后裂解细胞，进行蛋白定量，每孔20μg蛋白上样，120V电压进行10%SDS－PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，在100V，90min的条件下电转，5%脱脂奶粉（TBST配制）封闭1.5h后，IDO抗体按1∶1 000的比例与封闭液混合，4℃过夜孵育电转膜，TBST洗涤3次后，加入HPR标记的羊抗兔IgG二抗（1∶2 000），室温摇床振荡1h，TBST洗涤3次，加入ECL发光液后用X光片曝光。

1.4 RT－PCR检测细胞因子信号抑制因子（suppress of cytokine signaling，SOCS）的转录 采用2mmol／L NaB和100U／mL IFN－γ同时处理CNE2细胞6h，Trizol抽提总RNA；42℃60min，95℃5min进行逆转录；以逆转录的cDNA为模板，94℃变性5min，94℃变性30s，SOCS1 44℃、SOCS3 51℃ 退火30s，72℃延伸45s，35个循环，最后72℃延伸10min，终止反应，进行PCR反应（表1）。

1.5 Real time PCR 检测干扰素调节因子－1（interferon regulatory factor－1，IRF－1）的转录水平 取2mmol／L NaB，100U／mL IFN－γ单独或同时处理CNE2细胞6h后，Trizol抽提总RNA；42℃60min，95℃5min进行逆转录；用25μL标准PCR反应体系检测IRF－1的转录，25μL标准PCR反应体系：2×SYBR Green 12.5μL，PCR Forward Primer（10μmol／L）1 μL，PCR Reverse Primer（10μmol／L）1μL，DNA 模板 1～5 μL，加H2O到25μL。采用两步法进行Real time PCR反应：步骤1：95℃30s，步骤2：95℃5 10s，60℃40s40个循环，反应结束后分析Real time PCR的扩增曲线、融解曲线和标准曲线。IRF－1引物F：ATG GCT GGG ACA TCA ACA AGG，R：CAT GGC ACA GCG AAA GTT GG。

表1 检测SOCS1和SOCS3转录的引物

2 结 果

Western blot和RT－PCR检测NaB对CNE2细胞IDO、SOCS1、SOCS3转录的影响（图1～3）。结果显示SOCS1和SOCS3的转录没有显著变化。提示两者未参与NaB抑制IDO表达的信号传导。NaB抑制IRF－1的转录，间接影响IDO的表达，见图4。

图1 Western－blot检测结果NaB对CNE2细胞IDO表达的影响

图2 RT－PCR检测NaB及IFN－γ对CNE2细胞内SOCS1转录的影响

图3 RT－PCR检测NaB及IFN－γ对CNE2细胞内SOCS3转录的影响

图4 Real time PCR检测NaB及IFN－γ对CNE2细胞内IRF1转录的影响

3 讨 论

NaB是由厌氧菌分解发酵结肠中未经小肠消化的食物中的糖类（主要是纤维和蛋白）产生的，是结肠上皮细胞主要的能量来源，能刺激结肠肽或生长因子的释放，调节结肠黏膜血供，促进上皮细胞的增殖［6］。近来发现NaB能有效抑制肿瘤细胞增殖、诱导分化、促进凋亡的作用。NaB通过抑制组蛋白去乙酰化酶活性，导致组蛋白（非H1组蛋白H3、H4）高乙酰化，使组蛋白与相邻DNA的接触受抑制，改变了染色质的紧密结合，有利于转录因子激活特异性的基因，细胞分裂周期被阻滞于G1期，而达到NaB抗肿瘤的作用［7－8］。本研究发现NaB抑制IFN－γ诱导的IDO的表达。

IFN－γ调节基因的转录主要是通过Jak－STAT信号通路，其中有50多种细胞调节因子参与［9－10］。在IFN－γ未结合其受体时，IFN－γR1和IFN－γR2可能没有密切的联系。然而，最近研究发现在配体结合之前，IFN－γR1和IFN－γR2是装配好的。当IFN－γ与其受体结合后，受体的胞内区开放，Jak2自身磷酸化，然后磷酸化激活Jak1，两个Jak1可以形成一个招募STAT1同源二聚体的槽，STAT1二聚体接着被Jak2磷酸化，磷酸化后的STAT1二聚体从受体上脱离下来。IFN－γ激活其受体到STAT1二聚体从受体上脱离这一过程只需要1min就完成了。STAT1二聚体进入核内结合启动子，诱导或抑制IFN－γ调节的基因。STAT1结合的元件有GAS和ISRE。IFN－γ诱导的第一批基因转录发生在15～30min之内。许多IFN－γ诱导基因是细胞内的转录因子，它们由IFN－γ诱导转录，接着调节下一批基因的转录［11－12］。

细胞因子是一类由细胞分泌的调节细胞生长、分化、增殖的多肽小分子，它们不能直接进入细胞内发挥作用，而是通过细胞因子受体介导，经相应信号传导途径发挥其生物学效应。SOCS是信号传导通路JAK／STAT（Janus kinase／signal transduction and activators of transcription）的一个负性调控分子家族。SOCS家族有8个成员，每个成员都有一个中央SH2域，除了通常的蛋白质降解的泛素化机制，SOCS1和SOCS3能直接抑制JAK的酪氨酸激酶活性。

干扰素调节因子－1（IRF－1）是IFN－γ调节IDO表达通路上的关键因子，IRF－1通过IRF－E位调节靶基因的表达，IRF－E位的序列重叠于ISR－E的序列，此序列被ISGF3识别，其被Ⅰ型、Ⅱ型IFN－γ诱导［13］。在本研究采用Real time－PCR检测了NaB和（或）IFN－γ作用下IRF－1的转录水平，发现IFN－γ作用下IRF－1的转录水平显著增高，而NaB有效阻断了IRF－1的转录，结果提示NaB对IFN－γ调节IDO表达抑制，可能是通过抑制IFN－γ的下游信号通路来实现的。

本研究证明了NaB通过抑制IRF－1的转录，从而抑制IDO表达的细胞内信号通路，为其在鼻咽癌治疗的应用中提供了实验依据，为以IDO为靶点的鼻咽癌的免疫治疗提供一种新的策略。

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