槲皮素对人肝癌细胞生长、迁移能力的影响及机制研究＊

周 进，方 丽，姚文秀，熊竹娟，周 详，周 行，谢 华

（1.四川省肿瘤医院肿瘤内科，成都 610041；2.成都医学院第一附属医院消化内科，成都 610500）

恶性肿瘤是目前的医学难点。传统的治疗手段包括手术、放疗、化疗以及最近新兴的生物靶向治疗。然而，对于化学治疗来说，尽管药物众多，但强烈的不良反应限制了许多联合方案的运用，迫切需要寻找高效低毒的抗肿瘤新型药物。近年来，天然植物提取物——小分子黄酮类受到研究者们的强烈关注。黄酮类主要包括了姜黄素、槲皮素和厚朴等。他们存在广泛，体外及动物实验研究表明其能抑制子宫内膜癌、前列腺癌、结肠癌、鼻咽癌、肺癌、白血病等多种恶性细胞生长［1－4］。本课题研究拟通过生长抑制试验及划痕检测，观察槲皮素对人肝癌细胞（human hepatocellular carcinoma cell lines，HepG2）生物学行为的影响，并对其机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 槲皮素100mg（批号：051K1225）购自Sigma公司。使用时经二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解，Dulbecco最低必需培养基（Eagle′s minimum essential medium，DMEM）培养基稀释成所需浓度，其中DMSO终浓度小于0.1%。胎牛血清、DMEM培养基购自Gibco公司；胰蛋白酶（Tyrisin）购自Promega公司，HepG2细胞由四川大学生物治疗国家重点实验室留存。

1.2 HepG2细胞生长形态学观察 复苏冻存的HepG2细胞，于5%CO2、37%湿度的孵箱中培养。倒置显微镜（Olympus）对槲皮素作用前、后HepG2细胞的生长速度、形态、悬浮细胞比例进行比较、评估。

1.3 生存抑制实验［3－（4，5－dimethyl－2－thiazolyl）－2，5－diphenyl－2H－tetrazolium bromide，MTT］ HepG2细胞生长至对数期，胰蛋白酶消化，以104个／每孔的密度接种于96孔培养板，每孔体积约200μL。继续培养24h，依次加入浓度为10、20、50、100和200μmol／L的槲皮素稀释液，以含0.1%DMSO的DMEM培养基为空白对照，分别培养24、48和72h。加入MTT液（5mg／mL）20μL，孵育4h，加入100μL DMSO，振荡10min，全自动酶标仪（490nm）测定各孔的光吸收值（A），按公式：生存抑制率＝1－药物组A／空白对照组A×100%进行计算。

1.4 细胞划痕实验 将细胞培养于6孔培养皿，接种密度为1×105／孔。待细胞生长至约80%培养皿时，用200μL移液枪尖在细胞中做一划痕，宽度约2mm。磷酸缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）冲洗培养皿以移去上层悬浮细胞。加入50μM浓度的槲皮素稀释液，以正常DMEM培养基为空白对照。继续培养，使用数码照相系统（Carl Zeiss，Axiovert200，SIP No.MICO1223，德国）于实验后24、48h对同一划点照相，重复3次，并将图片数据输入Scion软件，计算划痕空白剩余面积，进行统计学比较。

1.5 Western blot检测 槲皮素作用前、后HepG2细胞中细胞 迁 移 黏 附 因 子 （Ras GTPase－activating－like protein，IQGAP1）的表达差异：细胞裂解液裂解HepG2细胞，提取总蛋白，定量。电泳分离、转膜。50g／L脱脂奶粉缓冲液4℃封闭过夜，加一抗IQGAP1（1∶200）室温振摇孵育2h，洗膜30 min后加二抗（1∶8 000）室温振摇孵育1h，洗膜，暗盒显影。内参选用β－actin。

1.6 统计学处理 应用SPSS11.0软件进行统计学数据处理，将MTT检测数据和划痕修复面积进行统计学处理，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 槲皮素处理细胞后形态学变化 正常HepG2细胞生长旺盛，紧贴培养瓶壁生长，轮廓清楚，胞浆饱满，细胞间接触紧密。经槲皮素处理后，细胞变圆，增殖变慢，附壁疏松，脱壁，周围碎片增多。随着槲皮素作用时间和浓度的增加，上述变化愈加明显。

图1 不同浓度槲皮素对HepG2细胞生存抑制效果

图2 HepG2细胞下的表达（倒置显微镜，×10）

图3 划痕实验空白面积比较

2.2 槲皮素对HepG2细胞增殖的影响 MTT显示，槲皮素对HepG2细胞生长有明显抑制作用，且具有剂量和时间依赖性。药物处理24h后，槲斗皮素浓度为10、20、50、100和200 μmol／L的抑制率分别为8%、18%、22%、27%、27%；药物继续作用至48h，50μmol／L浓度的抑制作用明显提高，达到51%（IC50），细胞生存抑制作用比较见图1。

2.3 加入槲皮素前、后HepG2迁徙能力的变化 正常生长的HepG2细胞生长旺盛，迁徙能力强，24h划痕面积明显减小，48hHepG2细胞几乎全部覆盖划痕。而在加入50μmol／L槲皮素作用48h后，HepG2细胞的迁徙能力明显减弱（图2）。对残留划痕面积进行比较，两组差异有明显的统计学意义（图3），P＜0.05。

2.4 槲皮素作用前、后HepG2细胞中IQGAP1蛋白的表达

实验48h获取Western blot结果（图4）相对于正常生长的HepG2细胞来说，加入槲皮素（50μmol／L）充分作用后，细胞中IQGAP1蛋白表达明显减低。

图4 Western blot检测槲皮素作用前、后HepG2细胞中IQGAP1蛋白的表达

3 讨 论

槲皮素在恶性肿瘤、炎症反应的作用是目前生命科学的研究热点。本实验主要观察槲皮素在HepG2细胞生长增殖和转移迁徙中的抑制作用。结果显示，槲皮素能明显抑制HepG2细胞的增殖生长，并对其迁徙能力产生强大的负调控作用。

关于槲皮素发挥抑制恶性肿瘤细胞生长的机制，目前的研究表明可能与下列因素有关：（1）失活原癌基因akt－1、bcr、ras，上调抑癌基因p21、p53等表达［5］；（2）抑制肿瘤新生血管生成：VEGF是血管生成的重要调节因子，而槲皮素则可以高效抑制VEGF表达［6］；（3）诱导凋亡：槲皮素能上调 Bax、Bad、Bcl－x等促凋亡基因，抑制凋亡负调控分子Bcl－2而诱导凋亡［7］；（4）阻遏热休克蛋白（heat shock protein，HSP）产物，HSP是重要的分子伴侣蛋白，能减轻高热、低氧、化学药物等刺激对细胞的损伤。槲皮素能下调 HSP70、HSP72、HSP90基因转录水平［8］；（5）抗氧化作用：槲皮素还能减弱细胞的氧化压力损伤［9］；（6）其他如逆转多药耐药（MDR）机制［10］。

最近，IQGAP1在恶性细胞黏附迁移中的中枢作用受到研究者的广泛关注。IQGAPs（Ras GTPase－activating－like protein）是真核细胞内一个相对保守的蛋白家族，位于染色体15q26，具有IQ和Ras－GTPase激活蛋白相关结构域（Ras－GAP－related domain，GRD）。IQ结构域由4个串联排列的IQ模体组成，能与钙调蛋白、肌球蛋白轻链和S100B结合［11］。GRD结构域可以和 Rho GTPase、cdc42、Racl结合［12］。目前，人类至少发现了3个家族成员，IQGAPl、IQGAP2和IQGAP3。IQGAPl是研究热点，许多学者认为由IQGAP1介导的细胞黏附迁移是肿瘤转移侵袭的基本步骤之一［13］。这个生命过程中，在上游蛋白Rac1、GTP等信号调节下，IQGAP1通过与α－连环蛋白（α－catenin）、β－连环蛋白（β－catenin）、钙调蛋白相互作用改变细胞之间的黏附能力［14］。有学者发现在抑制IQGAP1功能后，恶性细胞的黏附迁移能力显著降低，与正常时比较表现为较低的侵袭力［15］。

本研究观察到槲皮素作用前、后HepG2细胞生长及迁移能力的变化，并结合免疫印迹法中IQGAP1表达结果，推测槲皮素对IQGAP1基因的影响可能是其干扰HepG2细胞生长、减弱其黏附侵袭能力的途径之一。

［1］ 周进，方丽，姚文秀，等.细胞培养氨基酸稳定同位素标记——质谱技术测定槲皮素对人肝癌细胞热休克蛋白表达的影响［J］.中华肿瘤杂志，2011，33（10）：737－741.

［2］ Volate SR，Davenport DM，Muga SJ，et al.Modulation of aberrant crypt foci and apoptosis by dietary herbal supplements（quercetin，curcumin，silymarin，ginseng and rutin）［J］.Carcinogenesis，2005，26（8）：1450－1456.

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［13］Ren JG，Li Z，Sacks DB.IQGAP1integrates Ca2＋／calmodulin and B－Raf signaling［J］.J Biol Chem，2008，283（34）：22972－22982.

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