光学比浊法与连续血小板计数法监测血小板聚集功能的比较

关 杰，任军伟，朱 远，傅淑宏，白 洁，邓新立，丛玉隆

解放军总医院 南楼检验科，北京 100853

抗血小板治疗是心血管病患者重要的治疗方法，由于其治疗后仍存在出血或再次血栓的问题，临床实验室可以通过血小板功能监测患者治疗情况。血小板功能检测有诸多方法，许多文献对不同检测方法与临床预后的关系作了评价，其中，光学比浊法(light transmittance aggregometry，LTA)是受到广泛认可，甚至被认为是“金标准”的血小板功能检测方法，但存在如操作繁杂、质量控制难等问题[1-2]。血小板功能检测仪PL-11应用的连续血小板计数法，是以库尔特原理为基础的新型血小板功能检测方法，通过观察诱聚剂引起血小板聚集前后全血中血小板数量的改变来评估血小板功能。目前对于它的研究较少。本研究比较LTA与PL-11连续血小板计数方法对血小板功能的监测，评价PL-11连续血小板计数法与LTA的相关性及其监测血小板功能的价值。

对象和方法

1 对象 实验组选择本院2012年经血管造影确诊为冠脉疾病(coronary artery disease，CAD)的患者26例，且目前仅以氯吡格雷作为抗血小板药物，服药时间＞1个月。其中男性19例，女性7例，平均年龄(76.81±2.13)岁；排除使用其他影响血小板功能的药物(如阿司匹林，非甾体类抗炎药，噻氯匹定，双嘧达莫)、处于缺血性血管事件中或有出血性疾病的患者。另征集45例本院健康成年受试者为对照组，其中男33名，女12名，平均年龄(23.53±1.84)岁；排除患有任何慢性或者急性疾病、正在服用已知对血小板功能有影响的药物(包括非甾体类抗炎药)、吸烟或怀孕者。所有受试者对于本课题均知情同意。

2 仪器与试剂 CRONO-LOG Model 700血小板聚集仪(美国CHRONO-LOG公司)及配套试剂(ADP，浓度1 mmol/L)；PL-11血小板功能分析仪(南京神州英诺华医疗科技有限公司)及配套试剂(ADP，浓度50 mmol/L)；真空采血管为美国B.D.公司的含3.2%枸橼酸盐抗凝管。

3 标本采集 均于清晨使用3.2%枸橼酸盐抗凝真空管采集受试者肘静脉血：3管/人，其中1管用于PL-11检测，2管用于LTA检测。标本保存于37 ℃恒温箱，2 h内完成检测；检测前不能出现凝集。

4 血小板聚集实验(LTA) 两管枸橼酸盐抗凝血分别经800 r/min、5 min和4 000 r/min、8 min得到富血小板血浆(platelet rich plasma，PRP)和乏血小板血浆(platelet poor plasma，PPP)后各取500 μl加至比色杯。使用CRONO-LOG血小板聚集仪检测，以PPP为空白参照，5 μl浓度为1 mmol/L的ADP为诱聚剂加入至PRP(ADP最终浓度：10 μmmol/L)，PRP中透光度改变最大时得到血小板最大聚集率(max aggregation ratio，MAR)，以百分数表示。

5 PL-11连续血小板计数法 使用移液器吸取0.5 ml枸橼酸盐抗凝全血至PL-11检测试管并开始自动检测。全血标本经两次血小板基础值计数后，仪器自动加入40 μl浓度为50 mmol/L诱聚剂ADP(全血中最终浓度：4 mmol/L)，并连续间隔一定时间对血标本中血小板计数，当得到最低血小板计数时结果自动换算，以最大血小板聚集率表示，即{(初始血小板数－最低血小板数)÷初始血小板数}×100%。

6 统计学处理 统计软件使用SPSS13.0进行分析，连续变量采用-x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，两组结果相关性采用Pearson线性相关分析，多组间定量资料比较采用方差分析；P＜0.05为差异有统计学意义。绘图软件使用Prism 5 for Window version 5.01。

结 果

1 两种方法检测血小板聚集率比较 经独立样本t检验显示，LTA、PL-11分别检测健康志愿者和服药患者时，结果均有统计学差异(P＜0.000 1)；两种方法健康志愿者血小板聚集率值均大于服药患者组(表1)。在两组受试者中，LTA所检测的最大血小板聚集率范围高于PL-11，见图1。

表1 两种方法检测最大血小板聚集率比较Tab. 1 MAR detected by LTA and continuous platelet count with PL-11(%)

图 1 实验组与对照组两种方法检测结果Fig. 1 MAR detected by LTA and continuous platelet count with PL-11 in CAD patients and volunteers

2 两种方法相关性分析 所有受试者中PL-11与LTA结果MAR存在明显相关( r=0.766，P＜0.000 1)(图2A)；在服药患者组中，PL-11与LTA结果存在较好的相关性( r=0.616，P＜0.001)(图2B)；在健康志愿者结果中，未发现两种检测方法存在相关性( r=0.250，P=0.098)。

3 PL-11检测平均血小板体积(mean platelet volume，MPV)的变化 结果显示，两组受试者全血标本中加入诱聚剂ADP引起血小板聚集后，最大血小板聚集率主要出现在第3~5检测点，MPV值也在第3点后出现最大值，二者变化趋势一致。未发现健康者与患者初始MPV值的差异(P=0.321)；分别对两组受试者前6个检测点MPV进行方差分析时(图3)，第1、2个测试点间无统计学差异(P=0.998)，第3个测试点与第1、2个测试点间有统计学差异(P值均＜0.000 1)，与第4、5、6测试点间差异无统计学意义(P值分别为0.969，0.791，0.977)。

图 2 PL-11与LTA相关性分析 A：所有受试者B：服药患者组Fig. 2 Correlation between continuous platelet count with PL-11 and LTA in all subjects (A) and CAD patients (B)

图 3 PL-11检测血小板聚集时MPV变化 A：服药患者组B：健康志愿者组Fig. 3 MPV detected by continuous platelet count with PL-11 in CAD patients (A) and volunteers (B)

讨 论

自1962年血小板聚集功能的概念提出及20世纪80年代末英国血液学标准委员会(British com-mittee for Standards in Haematology，BCSH)提出血小板功能检测方法指南后，许多实验室检测方法问世，其中最常用方法是LTA，被认为是血小板功能检测“金标准”。尽管存在一些技术缺陷，仍有许多研究报道LTA检测结果与临床不良事件之间存在联系[3-7]。

本文通过PL-11与LTA检测健康人群及服用氯吡格雷患者经ADP诱导后血小板聚集功能变化，对两种方法进行评价，证实PL-11连续血小板计数法对全血标本检测与“金标准”的LTA方法在检测血小板聚集功能时具有较好的相关性。由于两种检测方法均为体外检测，受到采血、保存等因素的影响，二者检测结果最大血小板聚集率在正常范围内微幅波动，因此在健康人群中未见二者结果的相关性。

研究结果中LTA结果在健康人与服药患者组具有统计学差异，证实其能够反映血小板功能及监测服药后血小板功能改变，与之前文献结果一致[8-9]。PL-11连续血小板计数法同样能检测到两组受试者间差异。有文献报道，同样以血小板计数方法为基础的Plateletworks仪器检测到服用氯吡格雷后患者最大血小板聚集率也明显降低[10]。当以ADP为诱聚剂时，Van Werkum等[11]对CAD患者进行检测，Plateletworks与LTA之间结果存在较好相关( r=0.71，P＜0.000 1)，与本研究结果相近( r=0.766)。该作者认为，通过血小板计数检测血小板聚集功能有时间依赖性，当检测时间＞10 min时结果偏低。事实上，加入ADP诱聚后，PL-11连续进行血小板计数，在第3~5个测试点达到最大聚集率，时间为6~10 min，即血小板计数呈现先急剧减少而后缓慢增加的状态，故10 min后结果偏低。这种现象同样发生在LTA检测中，透光强度急剧达到最大时又逐渐减小。这种现象可能与ADP浓度有关，因为本试验中所使用ADP浓度较低，有资料显示，较低浓度的ADP刺激血小板聚集后易发生解聚，若提高浓度，可能使情况发生改变[12]。

本研究发现，无论在健康人或服药患者中，LTA检测结果范围均高于PL-11。实际上LTA是诱聚剂刺激后，血小板与纤维蛋白原结合产生光学变化后的反映，而PL-11检测的是经库尔特原理设定参数范围内认为是血小板的较小颗粒(血小板直径2~30 μm)，较LTA对小颗粒更敏感，故出现该现象。由此引起的问题可能是当LTA测得最大血小板聚集率处于0~100%中间水平与较低水平时，PL-11结果变化较小，反映血小板功能较小差异时不明显。不同检测标本可能也是带来这种差异的原因，因为在PRP中可能存在由于离心从细胞中释放出继续引起血小板聚集的物质[13]。这种推论需要进一步验证。

MPV被认为是血小板活性的标记物之一，增大的MPV提示血小板活性增强[14]。PL-11在连续计数血小板时，提供每个测试点的血小板MPV值，检测结果中聚集后剩余血小板体积增加(其原因可能是两个或者多个较小的血小板聚集成大血小板聚集颗粒引起)，为明确其活化聚集提供了依据。

综上所述，PL-11连续血小板计数法与光学比浊法在检测血小板聚集功能时有较好的相关性，较全面地提供了最大血小板聚集率、血小板计数、MPV变化情况，是一种可以供临床实验室选择的血小板功能检测方法。

1 Sharma RK， Voelker DJ， Sharma R， et al. Evolving role of platelet function testing in coronary artery interventions［J］. Vasc Health Risk Manag， 2012， 8：65-75.

2 Madsen EH， Saw J， Kristensen SR， et al. Long-term aspirin and clopidogrel response evaluated by light transmission aggregometry，VerifyNow， and thrombelastography in patients undergoing percutaneous coronary intervention［J］. Clin Chem， 2010， 56（5）：839-847.

3 Linnemann B， Schwonberg J， Mani H， et al. Standardization of light transmittance aggregometry for monitoring antiplatelet therapy：an adjustment for platelet count is not necessary［J］. J Thromb Haemost， 2008， 6（4）： 677-683.

4 Geisler T， Langer H， Wydymus M， et al. Low response to clopidogrel is associated with cardiovascular outcome after coronary stent implantation［J］. Eur Heart J， 2006， 27（20）： 2420-2425.

5 Angiolillo DJ， Fernandez-Ortiz A， Bernardo E， et al. Variability in individual responsiveness to clopidogrel： clinical implications，management， and future perspectives［J］. J Am Coll Cardiol，2007， 49（14）： 1505-1516.

6 Breet NJ， van Werkum JW， Bouman HJ， et al. Comparison of platelet function tests in predicting clinical outcome in patients undergoing coronary stent implantation［J］. JAMA， 2010， 303（8）： 754-762.

7 Cattaneo M， Hayward CP， Moffat KA， et al. Results of a worldwide survey on the assessment of platelet function by light transmission aggregometry： a report from the platelet physiology subcommittee of the SSC of the ISTH［J］. J Thromb Haemost， 2009， 7（6）：1029.

8 Saw J， Madsen EH， Chan S， et al. The ELAPSE （evaluation of Long-Term clopidogrel antiplatelet and systemic Anti-Inflammatory effects）study［J］. J Am Coll Cardiol， 2008， 52（23）： 1826-1833.

9 Lordkipanidzé M， Pharand C， Palisaitis DA， et al. Insights into the interpretation of light transmission aggregometry for evaluation of platelet aggregation inhibition by clopidogrel［J］. Thromb Res，2009， 124（5）： 546-553.

10 Craft RM， Chavez JJ， Snider CC， et al. Comparison of modified Thrombelastograph and Plateletworks whole blood assays to optical platelet aggregation for monitoring reversal of clopidogrel inhibition in elective surgery patients［J］. J Lab Clin Med， 2005， 145（6）：309-315.

11 Van Werkum JW， Kleibeuker M， Postma S， et al. A comparison between the Plateletworks-assay and light transmittance aggregometry for monitoring the inhibitory effects of clopidogrel［J］. Int J Cardiol，2010， 140（1）： 123-126.

12 Saniabadi AR， Lowe GO， Forbes CD， et al. Platelet aggregation studies in whole human blood［J］. Thromb Res， 1983， 30（6）：625-632.

13 Harrison P， Segal H， Blasbery K， et al. Screening for aspirin responsiveness after transient ischemic attack and stroke： comparison of 2 point-of-care platelet function tests with optical aggregometry［J］.Stroke， 2005， 36（5）： 1001-1005.

14 Goncalves SC， Labinaz M， Le May M， et al. Usefulness of mean platelet volume as a biomarker for long-term outcomes after percutaneous coronary intervention［J］. Am J Cardiol， 2011， 107（2）：204-209.