骨性关节炎患者关节滑液中结合珠蛋白水平与病情严重程度的相关性

廖伟雄，李众利，王 杰，王鸿丽，傅仰木，白晓伟解放军总医院 骨科，北京 00853；国家生物医学分析中心，北京 00850

骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是临床常见病和多发病。其主要特征为慢性持续性和进行性的关节软骨损坏，并最终导致关节功能障碍。近年来有学者发现，结合珠蛋白(haptoblobin，Hp)在OA患者关节滑液中浓度升高，检测滑液中Hp浓度有助于判断OA关节软骨的退变程度[1-3]。本研究拟采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定OA患者及非OA患者关节滑液中的Hp水平，并在关节镜下直接观察关节软骨的病变程度，研究Outerbridge软骨损伤分级、OA严重程度(HSS评分)与关节滑液中Hp水平的相关性。

资料和方法

1 研究对象 收集2011年7月-2012年2月在解放军总医院行关节镜诊治膝关节疾病患者59例。其中OA组41例(男17例、女24例，年龄45~79岁、平均61.5岁)，均符合1995年美国风湿病学会关于OA的诊断标准。非OA组18例(男12例、女6例，年龄14~42岁、平均27.6岁)，其中半月板损伤16例，盘状半月板2例，关节镜下均无明显关节软骨损伤。

2 标本收集 患者首次行关节镜手术时，取髌旁入路行膝关节镜穿刺抽取关节滑液原液2~3 ml，术后2 h内4 500 r/min 4℃条件下离心20 min，留取上清液分装于Eppendorf管中，快速冷冻，在-80 ℃冰箱内保存待测。

3 关节软骨损伤分级 术中根据关节镜检查所见，采用Outerbridge软骨损伤评分法对髌骨、股骨滑车、股骨内侧髁、股骨外侧髁、内侧胫骨平台和外侧胫骨平台共6个区域的关节软骨损伤进行评分，每个区域0~4分(图1)，各区域评分相加即得膝关节软骨损伤累计评分值，范围0~24分。根据Outerbridge软骨损伤评分可将OA分为Ⅰ、ⅡA、ⅡB、ⅢA、ⅢB、Ⅳ 6个级别。本实验41例OA患者中ⅡA级17例，ⅢA级15例，Ⅳ级9例。

图 1 Outerbridge分级A： 1分表面软化和肿胀； B： 2分有破裂和裂隙形成＜1.5 cm；C： 3分有破裂和裂隙形成＞1.5 cm； D： 4分软骨下骨暴露Fig. 1 Outerbridge classif i cation A: softening and swelling of articular cartilage (1 score); B:fragmentation and fissuring of articular cartilage affecting an area of less than 1.5 cm (2 scores); C: fragmentation and fi ssuring of articular cartilage affecting an area greater than 1.5 cm (3 scores); D: cartilage erosion to bone (4 scores)

4 OA严重程度分级 采用HSS评分从疼痛、功能、活动度、肌力、关节屈曲畸形、关节稳定性等方面评价膝关节OA的严重程度，分值越低，膝关节OA越严重。

5 Hp检测 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测滑液中Hp水平，分别设空白孔、标准品孔、待测样品孔。操作按试剂盒(美国R＆D公司提供)说明进行，每孔各加入PBS缓冲液稀释1 000倍的待测关节滑液10 μl， 37 ℃温育30 min； 洗液洗板5次，加入酶标试剂50 μl，混匀，37 ℃温育30 min，洗板后加入显色剂避光显色10 min。在450 nm波长下测量各孔的吸光度值(OD值)。根据标准品浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值计算出对应样品中Hp浓度。

6 统计学分析 采用SPSS13.0统计学分析软件，计量资料结果以-x±s表示，OA组与非OA组间数据比较应用t检验，多组数据间比较应用oneway ANOVA检验，滑液中Hp浓度与OA严重程度(HSS评分)之间的相关性采用Pearson相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 两组Hp水平比较 非OA组关节滑液Hp水平为(7.32±3.76) μg/ml，OA组为(23.04±13.19) μg/ml。OA组Hp水平高于非OA组(P＜0.001)。见图2。

图 2 两组关节滑液Hp水平比较Fig. 2 Hp levels in SF between two groups

2 两组软骨损伤评分与Hp水平比较 根据Outerbridge软骨损伤评分，OA组中ⅡA级17例，ⅢA级15例，Ⅳ级9例。ⅡA组滑液Hp水平为(10.50±4.55) μg/ml；ⅢA组为(27.43±7.41) μg/ml；Ⅳ组为(39.44±7.74) μg/ml。Ⅳ组关节滑液Hp水平明显高于ⅢA组(P＜0.001)、ⅡA组(P＜0.001)和non-OA组(P＜0.001)；ⅢA组Hp水平明显高于ⅡA组(P＜0.001)和non-OA组(P＜0.001)；ⅡA组Hp水平虽高于non-OA组，但差异无统计学意义(P=0.108)。见图3。

图 3 非OA组与不同严重程度OA亚组之间关节滑液Hp水平的比较Fig. 3 Hp levels in SF between non-OA patients and OA patients at different severity

3 滑液中Hp水平与OA严重程度的相关性 Hp水平与OA患者膝关节HSS评分呈负相关(r=-0.487，P=0.001)，表示Hp水平与OA严重程度呈正相关。见图4。

图 4 OA患者关节滑液中Hp水平与HSS评分呈负相关Fig. 4 Negative correlation between Hp levels in SF and HSS score in OA patients

讨 论

OA是一种以关节软骨退行性变和继发性骨质增生为特征的慢性关节疾病，常导致关节疼痛、僵硬、肿胀、活动受限和功能障碍。病程早期患者通常无明确症状和异常影像学表现，因此，症状结合影像学检查并不能实现OA的早期诊断。据一项流行病学调查显示，影像学表现异常的患者只有15%有临床症状[4]，说明影像检查学尚不足以准确反映OA的严重程度。

监测滑液内的生物标记物能够定量和动态地反映关节内的变化，有助于疾病的早期亚临床诊断，疗效检测和预后评估[5]。本研究发现，OA组滑液Hp水平明显高于非OA组(P＜0.001)，并与膝关节HSS评分呈负相关(r=-0.487，P=0.001)。表明滑液中Hp水平能在一定程度上反映OA的严重程度，可作为OA早期诊断与疗效监测的候选生物学标志。

Hp是一种α2-糖蛋白，由两条轻链(α链)和两条重链(β链)通过二硫键连接形成的四聚体[6]。Stevens等[7]研究发现IL-1β和TNF-α可通过刺激IL-6的合成间接促进Hp的表达与活性。因此，OA患者滑液中Hp水平的增高可能是上游细胞因子表达增加所致。本研究中，ⅡA级OA患者Hp水平虽高于non-OA组，但差异无统计学意义(P=0.108)，这可能与non-OA组膝关节存在一定的炎症反应，导致其滑液Hp水平增高有关。

OA患者滑液Hp水平的升高源于自身的保护机制。研究表明，Hp能够抑制环氧化酶(cyclooxygenase，COX)和脂氧化酶(lipoxygenase，LOX)的活性，从而抑制白三烯(leukotrienes，LTs)和前列环素(prostacyclin，PGI)等炎症因子的合成[8]。而LTs和PGE能够促进IL-1β和TNF-α的表达，通过抑制LTs和PGE的合成可以间接抑制IL-1β和TNF-α的释放。因此，OA患者滑液Hp的升高可以认为是一种继发性的负反馈调节机制。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)活性的升高导致OA患者软骨基质分解代谢增加[9]。据文献报道，Hp可以非特异性地抑制MMP-2和MMP-9的活性以防止细胞外基质的过度降解，维持细胞外基质的代谢平衡[10]。此外，Hp通过与透明质酸(hyaluronic acid，HA)结合形成HA-Hp复合物，可以防止氧源性自由基(oxygen acid freeradival，ODFR)对HA的破坏[11]。亦能保护HA免于多形核白细胞(polymorphonuclear leukocyte，PMNL)中过氧化氢酶的破坏[12]。目前有研究表明，Hp基因型可以应用于骨质疏松症发病风险的预测[6]。但Hp基因型是否与OA易感性有关有待进一步研究。

由于伦理学限制，目前我们只能选择非OA的其他膝关节疾病患者作为对照。另外，肝脏亦可合成Hp，因此不能排除OA组滑液Hp升高是由血液污染所致，超声介导下穿刺取样或扩大样本量可避免该情况。此外，实验可增设几组其他膝关节疾病作为对照，通过比较OA与其他膝关节疾病患者滑液中Hp水平来研究Hp是否在OA患者中特异性升高。

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