β1-40致伤的神经干细胞的存活率及 Caspase-3的活性变化

田嘉莹,盛宝英,齐志国

(佳木斯大学附属第一医院神经内科,黑龙江 佳木斯 154003)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是中枢神经系统退行性疾病以老年人进行性痴呆加重为其主要特征,特点为逐渐出现脑认知功能障碍、记忆能力减退、行为异常、社交困难,神经心理症及精神行为异常等的表现[1～2]。AD发病机制极其复杂,主要病理特征是老年斑和神经纤维缠结的沉积,伴脑皮质层神经元减少[3],老年斑的主要成分是β-淀粉样多肽(A β),其聚集被认为是 AD致病的核心因素。本实验以 A βl-40与神经干细胞共孵育,MT T法检测神经干细胞的存活率、比色法检测 Caspase-3的活性变化,探讨 A βl-40对神经干细胞致伤的作用,进一步探讨 AD的发病机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物、仪器及主要试剂

雄性 Wistar大鼠(＜24h),由佳木斯大学动物中心提供。实验共分两组,A β1-40处理组:在传代培养的神经干细胞加入 A β1-405 μm,②对照组:不加 A β1-405 μm余同 A β1-40处理组。分别孵育0h,12h,24h和48h。酶标计数仪 ELX800(Bio-TEK公司 );二氧化碳培养箱 (美国 Nurare公司 );DMEM/F12(Gibco);四甲基偶氮唑蓝 (M TT)、多聚赖氨酸(美国Sigma);A β1-40(Biosouxee公司 );Caspase分析试剂盒 (美国Promega公司);二氧化碳培养箱 (美国 Nurare公司);Nestin(北京博奥森生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠海马区神经干细胞的分离、传代培养及鉴定[4～7]

取出新生 Wistar大鼠(＜24h),无菌操作下打开颅腔,分离钳取海马区组织,用 Hank,s液漂洗 3次 ,并且移至预先加入适量 DM EM/F12培养液的容器中,将海马组织块剪成1mm3左右的小块,轻轻吹打制成单细胞悬液,调整细胞浓度,接种于培养基中,放入培养箱,隔 2～3d换半量培养液一次,每7天传代一次。将培养 2-3代的神经球滴在涂布0.1%多聚赖氨酸的无菌盖玻片上,37℃,5%CO2培养箱孵育2h后,用0.01MPBS洗涤,冷风吹干后,行 Nestin细胞免疫化学检测鉴定神经干细胞。

1.2.2 MT T还原法检测神经干细胞的存活率

两组传代培养的神经干细胞经不同处理后,培养不同的时间在37℃培养箱内,终止培养前4h每孔加入四甲基偶氮唑蓝 (M TT)溶液 (5mg/mL)20μL至终浓度为 1mg/mL,置37℃培养箱继续培养4h,采用翻板法将96孔板内的培养基弃去,终止培养,小心吸去孔内培养液。然后在每孔中加入溶解液二甲基亚砜 (DM SO)150μL,低速振荡 10min使结晶产物充分溶解。在酶标仪上以波长570nm检测每孔的 OD值。所检测 OD值的大小可反映神经干细胞代谢活性的强弱。每组设3个孔,实验重复3次 ,神经干细胞存活率的计算:细胞存活率=试验组光吸收值 /对照组光吸收值×100%。

1.2.3 比色法检测神经干细胞 Caspase-3的活性变化

将不同处理组细胞,用冰冷的 PBS在细胞表面洗两次,然后用细胞刮收集到 EPPendoff管内,4℃下450×g离心10min后收集细胞,然后放于冰上。用冰冷的 PBS洗一次,然后将其悬浮在100uL细胞裂解缓冲液(试剂盒提供 )中。以冻融循环(液氮-常温)的方式裂解细胞,然后在冰上孵育15min,4℃下 15,000× g离心 20min,然后收集上清液。用Bradford方法检测蛋白的浓度。按试剂盒依次在96孔板内依次 加样。加 2 μL DEVD-pN A底物 (10mm)到96孔板内。用parafilm封口膜将板子封严,37℃孵育4h。在405nm测量吸光度。计算 Caspase-3特异性活性。

1.3 统计学分析

采用 SPSS 17.0软件,计量资料用均数±标准差 (±s)表示,采用 t检验,多组间均数比较通过方差齐性检验后用方差分析,各组间两两比较用 q检验,P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 A β1-40不同培养时间各组神经干细胞存活率的变化

应用 M TT法对神经干细胞存活率进行观察,结果表明: A β1-40呈时间依赖性地降低神经干细胞的存活率。加入A β1-40后0h,12h,24h和48h,随着时间的延长,神经干细胞存活率逐渐降低,(P ＜0.05)。见表1。

表1 不同培养时间各组神经干细胞存活率的变化(%,±s)

表1 不同培养时间各组神经干细胞存活率的变化(%,±s)

注:a不同时间 Aβ1-40处理组与对照组相比,P ＜ 0.05;b24hAβ1-40处理组与 12hAβ1-40处理组相比,P ＜ 0.05;c48hAβ1-40处理组与24hA β 1-40处理组相比 ,P ＜ 0.05。

组别 0h(%) 12h(%) 24h(%) 48h(%)A β1-40处理组 98.67± 3.77 89.7± 3.2 69.3± 2.7a,b 62.7± 7.3a,c对照组 99.85± 3.33 99.95± 4.26 99.05± 5.10 99.79± 5.26

2.2 A β1-40孵育不同时间后神经干细胞 Caspase-3的活性变化

A β1-40处理组分别孵育 0h,12h,24h和48h后,致伤的神经干细胞 Caspase-3活性逐渐增加,在 24h达到高峰(P＜0.05),而空白组孵育0h,12h,24h和48h后神经干细胞 Caspase-3特异性活性未发生明显改变。A β1-40处理组与空白对照组相比较有显著性 (P＜0.05)见表 2。

表2 A β1-40不同孵育时间各组神经干细胞 Caspase-3的活性变化 (pmol/h˙μg,±s)

表2 A β1-40不同孵育时间各组神经干细胞 Caspase-3的活性变化 (pmol/h˙μg,±s)

注:a不同时间 Aβ1-40处理组与对照组相比,P ＜ 0.05;b24hAβ1-40处理组与 12hAβ1-40处理组相比,P ＜ 0.05;c48hAβ1-40处理组与24hA β 1-40处理组相比 ,P ＜ 0.05。

组别 0h 12h 24h 48h A β1-40处理组 5.79± 0.48 8.34± 1.85a 12.46± 0.47a,b 9.73± 0.34a,c对照组 5.34± 0.42 5.45± 0.63 5.12± 0.58 5.68± 0.66

3 讨论

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是神经系统退行性变性疾病之一。AD的病理特征为β-淀粉样肽聚集成的淀粉样斑块、脑神经细胞内异常磷酸化的 tau蛋白异常沉积构成的神经纤维病变,并伴有脑皮层神经细胞减少的血管淀粉样变性。淀粉样蛋白聚集与 A β的前体蛋白过量表达或基因突变密切相关。APP具有β样折叠构型,A β1-42约占10%左右,A β1-40约占 90%。本实验研究证实,A β1-40使神经干细胞的存活率随着时间的推移明显的下降。A β1-40孵育的神经干细胞0h,12h,24h和48h后 ,与空白对照组比较 ,致伤后神经干细胞的 Caspase-3的活性是逐渐增加的,24h达到高峰,而48h后有所下降,但仍高于空白对照组。表明神经干细胞在接受 A β1-40毒性致伤后 ,Caspase-3的活性随时间增加而递增,但并不是始终保持高水平激活状态,而是高峰后逐渐保持低水平,保持低活性状态发挥其促凋亡作用。表明A β1-40对神经干细胞有致伤作用可能通过凋亡途径导致细胞死亡的。由于 A β1-40对神经干细胞的毒性造成了神经干细胞不能及时补充 AD患者大脑缺失的神经元可能是 AD发病的原因之一[8]。提示研究 A β1-40致伤的神经干细胞死亡的机制可能为 AD的治疗提供潜在的分子靶点。

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