黄姜皂素重量测定法存在问题及原因探析

黄娟萍

（旬阳县科技局，陕西 旬阳 725700）

黄姜，学名盾叶薯蓣，是薯蓣科薯蓣属（Dioscrea.L）多年生草质缠绕藤本植物。世界上薯蓣科共有10属650种，广布于热带地区，中国有薯蓣属 80余种，其中富含薯蓣皂苷元的有17种。中国是盾叶薯蓣的原产地，两千多年前的《山海经》中就有“景山、北望少泽，其草多薯蓣” 的记载。是世界上薯蓣皂苷元含量最高的种。被《中华人民共和国药典》（2000版）收载，其根茎中薯蓣皂苷元（disogenin）（俗称皂素）的含量为1.1%～16.15%，是合成甾体激素类（steroid hormone）药物和甾体避孕药（steroid prophylactic）的重要医药化工原料。

影响黄姜皂素含量的因素较多，除分布区、海拔、土壤、水分、温度、光照等环境因子外，还有些其它因子。蒋朝晖等对盾叶薯蓣生育期皂苷元含量变化规律研究认为，皂苷在根茎中积累高峰期是现蕾及盛花期，结实期后明显下降；丁志遵等研究认为，盾叶薯蓣一般在萌芽期至开花盛期皂苷含量较高，老根茎皂苷含量高于新根茎；水分含量高的根茎皂苷含量亦高。李朝阳等研究认为，盾叶薯蓣的皂苷元含量与叶片宽窄程度之间也存在一定的相关性，宽叶型的平均皂苷元含量都较高，而长叶型的皂苷元含量都不高；潭远友等研究发现，盾叶薯蓣雄株中皂苷元含量高于雌株，种植时期越长，皂苷元含量越高。这些研究为生产优质黄姜提供有力的科学依据，也为黄姜的合理开发利用奠定了理论基础。

1 重量检测法的理论依据

薯蓣皂苷元是薯蓣属植物中薯蓣皂苷的配基，主要以薯蓣皂苷的形式与纤维素结合存在于黄姜的薄壁细胞中。薯蓣皂苷元是异螺旋甾烷的衍生物，在植物体内是以薯蓣皂苷配基形式存在的，即在 C3位通过皂苷键与糖链相连进而与植物细胞壁紧密连接。由于盾叶薯蓣皂苷元的结构特征和它在植物体内的存在形式，决定了提取它的步骤：首先必须使薯蓣皂苷元与植物细胞壁分开，再断开薯蓣皂苷元与糖连接的苷键，使薯蓣皂苷元游离出来，利用它的亲脂性，用丙酮或石油醚把它提取出来，盾叶薯蓣工业上用高标号的汽油来提取。

报道的薯蓣皂苷元的含量测定方法有多种，经典方法有重量法、比色法、库伦法，红外光谱法和薄层扫描法；现代方法有气相色谱法、高效液相色谱法（RP PHLC）等。重量检测法从20世纪50年代末一直沿用，此法操作直观，易于掌握，（除此检查法，其余都是采用光学仪器进行测量）此法包括直接酸水解法和预发酵酸水解法。

酸水解是使苷键断裂生成苷元和糖。传统的提取薯蓣皂苷元的方法是采用直接酸水解Rothrock法，即直接将盾叶薯蓣根茎用硫酸水解成苷元，然后用有机溶剂提取薯蓣皂苷元。郭文松等报道，用盐酸作为水解酸比硫酸好，工艺简单，效果差异不大，同时以盐酸为水解液时，加压法比常压法水解苷元收率高，缺点是盐酸对不锈钢设备有严重腐蚀。薯蓣皂苷元在植物体内存在形式的复杂性，使直接酸水解法仅能提取 1/4的皂苷元，且此法费时很多，薯蓣皂素收率较低，由于使用溶剂汽油，易发生危险；另外，盾叶薯蓣中的淀粉和纤维素等其它成分也在酸水解过程中被破坏而不能利用，因此该工艺不够理想。

预发酵法，一般认为预发酵法可提高薯蓣皂苷元的收率。反应条件也比较温和，保持了有效成分的本来理化性质，适合实验室的检测使用。就是我们目前采用的检测方法。

2 预发酵酸水解检测法的主要操作流程

主要工艺流程，见图1。

图1 皂素生产工艺流程图

第一，从种质资源圃中取回休眠的黄姜新鲜块茎，洗净表皮及须根上的细沙泥土杂质，除去腐烂、虫害的部分。沥干水，切碎，在自然条件下晾晒，使其水分达到20～30 %即可，再用万能粉碎机粉碎，过90目筛子。

第二，取黄姜干粉80 g，加40 ℃的水适量（黄姜粉：水＝1∶3）搅拌均匀，使其充分吸水至饱和。用塑料纸包严封口，置于40 ℃恒温培养箱发酵至48 h，取出后有气泡和薯蓣粉的酒香味。

第三，发酵好的样品移入1000 ml烧瓶中，加入适量水、浓盐酸配制成2个当量浓度的水解液，塞上带空气冷凝管的胶塞，置800 W的电炉（温度控制在104 ℃）反复回流4 h。

第四，过滤，用蒸馏水冲洗水解渣至中性（pH＝7）。

第五，将其置于80℃恒温箱6 h烘干，并称重打包。

第六，用120号汽油置索氏提取器中萃取6 h。然后取玻璃皿，接少量提取汽油于皿中，挥干，加入数滴醋酸酐，将沉淀溶解，沿皿壁加入浓硫酸一滴，观察相交面是否有紫红色，反应出现，有为阳性反应，应继续提取，无反应说明已提取完成。

第七，静置12 h以上，用真空泵离心抽滤，洗出皂素。

第八，置80 ℃恒温箱1.5 h烘干皂素称重。

第九，精确计算出生药皂素含量和水解干燥物收率。

3 重量检测法存在的主要问题

目前这种重量检测皂素的方法在试验室和大工厂普遍使用。虽然安康地区使用该法近10年时间，仅旬阳县黄姜研究所就做了1358个样品，但笔者认为该法还是存在一定的不足，主要表现在：

第一，样品的前期处理过程复杂，要求器械精度高。首先要洗净，不能有残余的任何杂质，像泥巴细沙之类的，也不能有腐烂虫害的部分。其次要求粉碎程度高，必须先用菜刀切碎成细小颗粒，再晾干，粉碎（用纺锤形刀片的万能粉碎机），过筛。最后，还要在发酵之前使粉末充分吸水，胀破细胞壁。

第二，该检测方法耗时长，人力、水、电消耗量大。检测一个黄姜样品，除去样品前期处理时间，实验室还要历时70 h左右。消耗电力50余度，水3 t，需要安排6个工作日。

第三，此法由于影响因素较多，产品质量不稳定，平行样检测出的实验数据存在误差，甚至有时误差较大。为了提高实验数据的准确性，又要耗费更多的人力和财力。

4 重量检测法存在问题的主要原因

通过联合高等院校专家教授分析，加上我们自己不断对比实验，发现产生上述问题的原因主要有以下几个方面：

第一，原料的粉碎状况，粉碎的粒度以现有条件达不到实验的要求。在发酵过程中，黄姜粉末颗粒不能充分吸水，植物细胞壁不能彻底完全胀破，薯蓣皂苷元与植物细胞壁不能完全分开，皂苷元与糖连的侧链不能完全断裂断裂，影响后续皂素的分离。

第二，因黄姜本身含有大量的淀粉（50%）和纤维素（45～50%）（以干姜计），在发酵过程和水解时，就会直接干扰黄姜皂素的分离，使皂素无法完全彻底从皂甙中游离出来而与酸结合，从而残留在废渣中。

第三，即使有合适的水解条件，如果酸浓过高就可能有30%或更多脱水产物——去氧替告皂甙元生成，测出皂素含量高，但熔点低，皂素品质下降，而且△3，5－去氧替告皂苷元很难与皂素分离，增加了后续工艺流程的难度。

第四，水解后的干燥物（烘干至水分含量在6～10%）水分过大，影响溶剂和料面的接触，不能完全提取。

第五，提取温度的控制（80 ℃）：温度低，则提取率低，若温度高，则产品色泽较深。如果干燥物粒度直径不在5～10 mm，即使提高温度，延长时间也无济于事。

第六，洗皂素：因反复的冲洗，致使部分皂素顺着布氏漏斗与滤纸的边缘流进母液而不能回收，使所测数据偏低。

5 重量检测法存在问题解决的思考

针对上述问题及其原因，一方面我们要通过反复实践完善实验操作流程，具体方法如下：①多做样品的平行样，减少误差；②是勤于观察实验的反应现象，使实验反应条件充分，提高检测数据的准确性；③是提高业务水平，规范操作，减少人为原因存在的问题。另一方面应联系相关科研院校，尽快将其已研究成功并获得专利的高、精、尖的最新测定方法引入我市，如武汉大学生命科学院获取专利的酶联吸附法，该检测方法是目前色谱法外最快速、灵敏、准确、简便的测量方法。此法除去样品的前期处理时间，检测一个样品仅需7～8 h，且同时可检测96个样品。该方法不存在强腐蚀、高危险的隐患。再如二氧化碳超导法以及四川大学王南教授在旬阳恒源化工有限公司领创的酶解法提取盾叶薯蓣皂素技术。此方法与我们现使用的重量法最大的区别是不用发酵，直接用酶解替代酸解，简便易行。

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