腹腔和皮下注射D-半乳糖衰老大鼠模型分析

姜国良 于 晓 徐 恺 刘 云

(中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛 266003)

目前，人类衰老方面的研究，多采用建立衰老动物模型的方法。衰老动物模型分为自发性衰老动物模型和实验性衰老动物模型。实验性与自发性相比可控性强，易于回溯，缩短建模时间降低建模成本，优化实验流程。目前，可以利用3种方法构建衰老动物模型，其中 D-半乳糖注射法最常用〔1，2〕。D-半乳糖是一种衰老诱导剂。它是一种由六个碳和一个醛组成的单糖，归类为醛糖和己糖。D-半乳糖诱导建立衰老动物模型多采取腹腔和皮下注射D-半乳糖两种方法。但是对两种注射方法所建立的衰老动物相关指标的差异一直未见报道〔3〕。本实验分别采用皮下和腹腔注射D-半乳糖两种方法构建衰老动物模型，通过胸腺和脾脏指数、血液及组织生化指标检测、组织切片观察讨论两种模型间的差异，为实验动物模型建立的标准化提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 D-半乳糖(国药集团化学试剂有限公司)，葡萄糖测定试剂盒，C反应蛋白(CRP)测定试剂盒，丙二醛(MDA)测定试剂盒，总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测试盒，单胺氧化酶(MAO-B)测试盒，测定试剂盒均购自南京建成科技有限公司，其余配置试剂均为普通市售分析纯。

1.2 实验动物 3月龄雄性Wistar大鼠(SPF级)30只，体重174 g±5.3 g，购自山东鲁抗医药股份有限公司，合格证号:SCXLC鲁20080002。动物房温度(22±2)℃，湿度(60±15)%。自然光照。饲喂大鼠饲料，购自山东鲁抗医药股份有限公司。

1.3 实验分组和操作 适应1 w后开始实验。将30只大鼠随机分为空白组10只，腹腔注射组10只，皮下注射组10只。利用 D-半乳糖0.125 g·kg－1·d－1连续腹腔和皮下注射40 d。皮下注射部位均为右后大腿内侧。末次给药后24 h，分别称量3组老鼠的体重，摘眼球取血，离心取血清。另分别取胸腺，脾脏，腹部皮肤和脑组织。称取胸腺和脾脏重量，皮肤和脑组织一部分在－20℃低温保藏，另一部浸泡Bouin固定液固定，准备进一步制作切片。

1.4 指标测定

1.4.1 计算胸腺指数和脾脏指数 根据称量所得的体重，胸腺重量和脾脏重量计算胸腺指数和脾脏指数。

1.4.2 血液及组织生化指标测定 血清葡萄糖，CRP，MDA，T-SOD，GSH-Px含量，皮肤羟脯氨酸含量以及脑B型单MAO-B含量测定均按照测试盒说明书进行，采用分光光度法。

1.4.3 组织切片制作 选取浸泡改良Bouin固定液固定脑和皮肤组织，制作常规石蜡切片，切片厚度6μm，HE染色后在Nikon显微镜下观察、拍照。

1.5 统计学分析 各组实验数据均用SPSS13.0统计软件做统计学处理。所得结果均以x±s表示，并做单因素方差分析。

2 结果

2.1 大鼠胸腺指数和脾脏指数 在胸腺指数上，皮下注射组、腹腔注射组与空白组相比均显著下降(P＜0.01)。皮下注射组与腹腔注射组之间无明显差异，但表现出一定的下降趋势。在脾指数上，皮下注射组、腹腔注射组与空白组相比均没有显著差异(P＞0.05)。皮下注射组与腹腔注射组之间也没有显著差异，仅表现下降趋势。见表1。

表1 不同注射组大鼠的胸腺指数和脾脏指数(x ± s，n=10)

2.2 血液生化指标 在血糖含量上，三组之间没有明显差异(P＞0.05)。CRP含量上，腹腔注射组、皮下注射组与空白组相比均显著升高(P＜0.01)，皮下注射组与腹腔注射组相比明显升高(P＜0.05)。在MDA含量上，腹腔注射组、皮下注射组与空白组相比均显著升高(P＜0.01)，腹腔注射组与皮下注射组相比明显升高(P＜0.01)。T-SOD和GSH-Px活性上，腹腔注射组、皮下注射组与空白组相比均明显降低(P＜0.01)，腹腔注射组与皮下注射组相比活性降低更加显著(P＜0.01)。见表2。

表2 不同注射组大鼠血液生化指标(x ± s，n=10)

2.3 组织生化指标 在脑MAO-B活性上，皮下注射组、腹腔注射组与空白组相比均显著升高(P＜0.01)，皮下注射组与腹腔注射组相比无明显差异，仅表现下降趋势。在皮肤羟脯氨酸含量上，腹腔注射组和皮下注射组与空白组相比均显著降低(P＜0.01)，皮下注射组与腹腔注射组相比明显降低(P＜0.05)。见表3。

表3 不同组大鼠的组织生化指标(x ± s，n=10)

2.4 皮肤组织切片 空白组皮肤厚度正常，表皮角质层完整，基底层细胞排列整齐。腹腔注射组表皮厚度明显变薄，表皮细胞结构改变且数量明显下降，基底层细胞少数出现空泡，整体排列仍较整齐。皮下注射组皮肤厚度进一步变薄，表皮有部分缺失，基底层细胞嗜碱性降低，排列疏松紊乱;真皮弹力纤维增粗，堆积，排列不规则。见图1。

2.5 脑组织切片 空白组大脑白质内神经元细胞体清晰可见，结构正常。腹腔注射组大脑白质和皮下注射组大脑白质内神经元细胞体胞质不清晰，树突和轴突缩短消失。腹腔注射组和皮下注射组间差异不大。空白组大脑灰质内神经纤维排列紧密，结构正常。腹腔注射组大脑灰质内神经元细胞肿胀，但数量仍较多。皮下注射组大脑灰质内神经元纤维排列疏松，神经细胞数量明显减少。见图2。

图1 各组皮肤组织切片(HE，×400)

图2 各组大鼠大脑白质与灰质病理图片(HE，×400)

3 讨论

D-半乳糖导致机体衰老的主要机制是:通过连续注射使D-半乳糖在机体细胞内累积。细胞内的醛糖还原酶可以将其还原成无法被细胞代谢的半乳糖醇。胞内堆积的半乳糖醇可以影响细胞的渗透压，使细胞肿胀，进而使细胞功能障碍、代谢紊乱，最终导致机体衰老〔4〕。本实验表明，两种注射方法所建立的衰老大鼠模型在各项血液生化指标上均有衰老体现，衰老大鼠模型已经建立。

衰老机体内较高含量的还原糖可与蛋白质、脂类、核酸等大分子中的游离氨基发生非酶促糖基化反应。其通过加成反应产生的早期产物经重排、脱水形成带荧光的棕色化合物，即晚期糖基化终末产物AGEs。AGEs随年龄增长不断积累，从而促进机体衰老〔5〕。通过试验比较，腹腔注射和皮下注射D-半乳糖没有引起衰老大鼠血糖升高，与以往的实验结果一致〔6〕。其原因可能是注射剂量和时间不足〔7〕。

体内C反应蛋白水平能够对机体的健康及衰老状况起到警示作用〔8〕。实验结果显示，两种衰老大鼠模型的CRP水平较空白组明显升高，说明衰老机体正处于不健康状态。这可能与各器官、免疫系统等功能性衰退有关。皮下注射组的CRP水平较腹腔注射组较高可能是由于皮下注射D-半乳糖延长了D-半乳糖对机体的作用时间，从而使机体对非健康状态更加敏感。

衰老的自由基学说认为体内产生过多的氧自由基会将不饱和脂肪酸氧化成超氧化物，从而形成脂褐素。过多的氧自由基还会破坏细胞膜，使蛋白质和酶变性，从而加速衰老。氧化物含量和抗氧化酶的活性是评价机体氧化水平的主要指标。MDA是自由基与脂质中不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应所产生的过氧化脂质的分解产物。因此，MDA的含量可以反映过氧化程度，从而反映衰老程度。超氧物歧化酶(SOD)和GSHPx是机体内重要的清除自由基的抗氧化酶，可以作为衰老的直观指标。试验中，两种衰老大鼠模型较空白组高的MDA含量，较低的T-SOD和GSH-Px的活性反映了机体的衰老状态。即，自由基的累积和抗氧化酶活性的降低，与以往实验结果一致〔9〕。皮下注射组的MDA含量较腹腔注射组高，但腹腔注射组T-SOD和GSH-Px的活性较皮下注射组更低，表现出两种衰老大鼠模型在自由基代谢上的差异。说明腹腔注射D-半乳糖建立的衰老大鼠模型的自由基代谢水平较皮下注射组差，自由基的累积程度较高。因此，在进行自由基代谢相关领域的研究时，选取腹腔注射D-半乳糖建立衰老大鼠模型可能会取得更加显著的效果。本文结果说明注射D-半乳糖可以使免疫系统功能下降，但是在两种衰老大鼠模型间差异不大。这个结果与徐智等〔10〕的研究结果一致。

脑MAO-B在衰老机体内的累积可以导致儿茶酚胺类神经递质的减少，使大脑的反应和思维活动迟缓，是衰老的重要指标。实验结果显示腹腔注射组，皮下注射组MAO-B活性与空白组相比明显升高，而腹腔注射组与皮下注射组相比略有升高。脑组织切片的结果也显示了这一点。从初步构建脑衰老模型的角度出发，注射D-半乳糖可以起到一定的效果，且腹腔注射的效果好一些。

皮肤羟脯氨酸含量的下降可以显示真皮内胶原蛋白含量的降低，从而反映衰老程度〔11〕。实验结果显示腹腔注射组，皮下注射组与空白组相比皮肤羟脯氨酸含量明显下降，而皮下注射组与腹腔注射组明显降低。这与皮肤组织切片的结果一致。说明，皮下注射D-半乳糖的吸收途径对皮肤的作用更加直接。因此，从实验结果可见，在皮肤衰老模型的研究中，皮下注射D-半乳糖效果明显优于腹腔注射D-半乳糖构建的大鼠模型，可以应用于该领域模型的构建。

腹腔注射和皮下注射D-半乳糖构建的衰老大鼠模型，两种方法均可建立稳定可靠的衰老大鼠模型，且两种模型均能在多层面上反映出机体的衰老情况。从应用角度出发，腹腔注射D-半乳糖构建的大鼠模型较皮下注射D-半乳糖构建的大鼠模型在机体应激研究、自由基代谢研究、脑衰老研究中有较好的效果。而皮下注射D-半乳糖构建的大鼠模型较腹腔注射D-半乳糖构建的大鼠模型在皮肤衰老模型的研究中效果更突出。

本文发现，注射D-半乳糖构建衰老大鼠模型，腹腔注射的方法要比皮下注射方法造模效果更加明显。这种差别可能是因为腹腔注射法是将D-半乳糖注射入腹腔胃肠道浆膜以外，腹膜以内。由于腹膜的面积广大且密布血管和淋巴管，因此腹膜有很强的吸收能力，每小时可吸收动物体重3% ～8%的液体，因而对血液指标的影响更大。皮下注射D-半乳糖则是将D-半乳糖推入皮下结缔组织，D-半乳糖经皮下结缔组织间的毛细血管、淋巴管吸收进入血液循环，因而对皮肤组织和羟脯氨酸含量的影响更大。两种不同的注射方法导致大鼠机体对D-半乳糖的药代动力学差异，而药代动力学上的差异是导致两种衰老大鼠模型之间差异的主要原因。

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