4种ELISA方法检测牛口蹄疫非结构蛋白抗体的ROC评价

王 欢，张润祥，李 迪，曹永生，高明春，王君伟

口蹄疫（Foot and mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot and mouth disease，FMDV）引起的急性，高度接触性传染病，主要感染偶蹄家畜，给畜牧业的发展带来严重威胁。FMDV是小RNA病毒科口蹄疫病毒属成员，有7种血清型，分别为O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3以及 Asia1型，型间无交叉免疫保护［1］。

由于ELISA的检测抗原、操作形式等各有不同，因此其敏感性和特异性存在一定差异，实际应用中需要对这些方法进行客观的比较评价，国外对NSP－ELISA 的评估进行了多篇报道［2－4］，泛美口蹄疫中心（PANAFTOSA）和英国Pirbright实验室分别制作了评价各种方法的牛源血清盘，而国内尚无对牛口蹄疫NSP－ELISA的评价报告。

ROC曲线（receiver operating characteristic curve）分析被认为是一种试验评价中的理想和经典方法［5］，是将检测结果划分为若干临界点，以每个临界点对应的敏感性为纵坐标，“1－特异性”为横坐标，作图得到的曲线，可以比较直观的看出敏感性与特异性之间的关系，通过计算ROC曲线下面积（Area Under the ROC，AUC）来评价诊断方法的准确性，是一种全而、准确评价诊断试验的有效工具［11］。本研究以世界公认的商品化试剂盒Ceditest®ELISA为参考标准，对国内3种商品化ELISA试剂盒和实验室建立的8BF－ELISA方法［6］运用ROC曲线对4种ELISA方法进行综合性评价。

1 材料与方法

1.1 试验血清 用Ceditest®ELISA作为检测标准，批号：07K570，164份血清来源于2个已知感染过FMD的且痊愈的牛场，其中85份阳性，79份阴性。

1.2 4种ELISA试剂盒 口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体检测ELISA试剂盒，（以下简称ELISA A）由中国农业科学院兰州兽医研究所生产，批号：2008022608；口蹄疫病毒非结构蛋白抗体单抗阻断ELISA试剂盒，（以下简称ELISA B）由北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产，批号：CB2008031201；3B合成肽ELISA试剂盒，（以下简称ELISA C）由上海优耐特生物医药有限公司生产，批号；200806023；由本实验室建立的8BF－ELISA方法，（以下简称ELISA D）［13］。

1.3 结果判定 ELISA A临界值＝（OD样品－OD阴性）/（OD阳性－OD阴性），其临界值小于0.2，为阴性；大于0.3为阳性；在0.2－0.3之间为可疑，可疑样品进行复测如果大于0.2为阳性；ELISA B临界值＝（阴性对照孔OD均值－样品孔OD均值）/阴性对照孔OD均值＊100%

被检样品阻断率（Inh%）大于等于40%为抗体阳性；在25%－40%之间为可疑；小于25%为阴性；ELISA C临界值＝0.23＊阳性对照孔平均OD值；ELSIA D临界值判定同ELISA A。

1.4 统计学处理 用EXCEL2007和PASW/SPSS Statistics18联合进行统计分析，通过对ROC曲线下面积（AUC）大小和Youden指数［7］分析，来确定ELISA检测方法阳性判定结果的准确性和最适临界值，评价4种ELISA检测方法的检测能力。

2 结 果

2.1 4种ELISA检测方法对试验样本的检测结果4种ELISA方法的检测结果见表1，因为ELISA A B D均设有可疑区间，进行复测后把ELISA－A和D的临界值设为0.2，ELISA B设为0.25，4种ELISA 方 法 的 检 出 率 （Ef）分 别 为95.12%，89.02%，84.76%，93.29%。经X2检验，ELISA C的检出率低于其他3种检测方法，且差异有统计学意义（P＝0.006＜0.01），其他3种ELISA方法的检出率之间差异无统计学意义（P＝0.099＞0.05）。

表1 4种ELISA方法对确定血清FMDV－NSP抗体的检测结果Tab.1 Four ELISA methods for determination of serum FMDV－NSP antibody test results

4种ELISA检测方法的敏感性分别为96.47%（82/85），95.29% （81/85），70.59% （60/85），92.94%（79/85）；特异性分别为93.67%（74/79），82.28%（65/79），100.00%（79/79），93.67%（74/79）。

2.2 应用ROC曲线分析 见图1，曲线起始部分上升较陡，表明试验分辨率较精确；并且4种ELISA的ROC曲线均在参考线以上，并远离标准线，且几种方法相应的ROC曲线非常接近。曲线下的面积见表2，根据Swets［8］判断规则，面积越大，判断越有效；面积越小，判断价值越低。其中面积在0.5以下者试验没有诊断价值，面积在0.5～0.7之间有较低的准确性，面积在0.7～0.9之间有一定的准确性，在0.9以上者，则有较高的准确性ROC面积在0.937～0.982之间，表明4种方法都有很高的准确性。比较4种ELISA方法的ROC曲，线下面积（AUC），差异均不显著。

2.3 确定最佳临界值 以图1的ROC曲线上的各切点作为阈值，计算相应的敏感性、特异性及Youden指数。Youden指数是分析敏感性和特异性的综合评价指标，可以避免对于敏感性和特异性的偏移，能较客观的反映实际情况。从图2中可明显看出Youden指数和试验检出率呈正相关的关系，并且在某一临界值附近有相同的波峰，说明在这一临界值附近有着很好的检测能力。

图1 4种ELISA方法对FMDV－NS抗体检测结果的ROC曲线Fig.1 ROC curves of the four ELISAs for detection of FMDV－NSP antibodies

表2 曲线下的面积Tab.2 Area under the curve

图2 在不同临界值下，试验检出率与Youden指数的变化情况Fig.2 Detection rates and Youden index changes in the different threshold

图2中的Youden指数，对应的切点为ROC曲线上的最佳临界值，表3给出了四种ELISA方法在最佳临界值时的敏感性、特异性和检出准确率的比较。从表3能明显看出在ROC曲线下应用最佳临界值来检测FMDV－NSP抗体要比使用制造商推荐的临界值时的检测准确率要高，且4种方法的准确率之间无显著性差异（P＝0.461＞0.05）。

表3 四种ELISA在最佳临界值时的敏感性、特异性和准确性Tab.3 Sensitivity，specificity and accuracy of the four ELISAs based on the optimization of the cut－off

3 讨 论

2006年－2008年6个国家科学家通过对已知阴阳性血清检测［9］，通过和3种商品化试剂盒，国际动物卫生组织（OIE）参考方法（NCPanaftosascreening）及意大利室内质控方法（3ABC trapping－ELISA）进行ROC曲线和极大似然值法［17］，贝叶斯定律［10－11］等方法的全面比较分析评价：在商品化试剂盒中，Ceditest®ELISA的敏感性和特异性最优，检测结果接近OIE参考方法。因此本研究选择了Ceditest®ELISA作为试验的“金标准”，对国内几种NSP－ELISA进行了比较评价。表1可看出，ELISA C的相对特异性为100%，但敏感性只有70%，而ELISA A敏感性和特异性都超过了90%，但在临界值＞＝0.3时特异性为98.7%，敏感性为89.2%；ELISA B在抑制率为40%时，敏感性和特异性分别77.6%和98.7%；ELISA D在临界值为0.3时特异性和敏感性分别为97.4%和83.5%。但经过ROC分析，用Youden指数结合敏感性和特异性给出另一临界值时，4种检测方法的敏感性和特异性趋于平衡，检测准确率都有所增加。4种方法有3种都设有可疑区间，可以通过对可疑区间的复测来增加检验准确率，所以，在ELISA方法的建立过程中确保一定的可疑区间是比较科学的。

用ROC分析ELISA方法的检测能力，国内在兽医研究方面的文献相对较少。在本研究中，ROC分析ELISA A给出最大的AUC（见表2），要比其他3种方法稍微高一点，但其他三种方法的AUC也都超过了0.9，表明其他3种ELISA方法检测能力也是比较好的，只是ELISA C的检测敏感性略低，不太适合做大规模临床样本的检测，但特异性较高可作为临床样本的确诊试验。综合评估，在优化临界值后的ELISA A，ELISA B和ELISA D的敏感性和特异性都大于90%，均可用于大规模临床样本的初筛试验。

［1］Alexandersen S，Zhang Z，Donaldson AI，et al.The pathogenesis and diagnosis of foot－and－mouth disease［J］.J Comp Pathol，2003，129（1）：1－36.DOI：10.1016/S0021－9975（03）00041－0

［2］Moonen P，van der Linde E，Chenard G，et al.Comparable sensitivity and specificity in three commercially available ELISAs to differentiate between cattle infected with or vaccinated against foot－and－mouth disease virus［J］.Vet Microbiol，2004，99（2）：93－101.DOI：10.1016/j.vetmic2003.12.003

［3］Bronsvoort BM，Sorensen KJ，Anderson J，et al.Comparison of two 3ABC enzyme－linked immunosorbent assays for diagnosis of multiple－serotype foot－and－mouth disease in a cattle population in an area of endemicity［J］.J Clin Microbiol，2004，42（5）：2108－2114.DOI：10.1128/JCM.42.5.2108－2114.2004

［4］Dekker A，Sammin D，Greiner M，et al.Use of continuous results to compare ELISAs for the detection of antibodies to nonstructural proteins of foot－and－mouth disease virus［J］.Vaccine，2008，26（22）：2723－2732.DOI：10.1016/j.vaccine.2008.03052

［5］Copas JB.Overestimation of the receiver operating characteristic curve for logistic regression［J］.Biometrika，2002，89（2）：315－331.DOI：10.1093/biomet/89.2.315

［6］Cheng W，Ni Z，Pan X，et al.Receiver operating characteristic curves to optimal operating point and doubtable value interval［J］.Mod Prev Med，2005（7）：729－731.（in Chinese）

陈卫中，倪宗瓒，潘晓平，等.用ROC曲线确定最佳临界点和可疑值范围［J］.现代预防医学，2005（7）：729－731.

［7］Gao M，Zhang R，Li M，et al.An ELISA based on the repeated foot－and－mouth disease virus 3B epitope peptide can distinguish infected and vaccinated cattle［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2012，93（3）：1271－1279.DOI：10.1007/s00253－011－3815－0

［8］Chen P，Wang B，Mo Y.Comparison of several statistical inference methods for diagnostic test［J］.Chin J Health Stat，1995（5）：8－11.（in Chinese）

陈平雁，王斌会，莫一心.几种诊断试验统计方法的比较［J］.中国卫生统计，1995（5）：8－11.

［9］Swets JA.Measuring the accuracy of diagnostic systems［J］.Science，1988，240（4857）：1285－1293.DOI：10.1126/science.3287615

［10］Brocchi E，Bergmann IE，Dekker A，et al.Comparative evaluation of six ELISAs for the detection of antibodies to the nonstructural proteins of foot－and－mouth disease virus［J］.Vaccine，2006，24（47－48）：6966－6979.DOI：10.1016/j.vaccine.2006.04.050

［11］Goris N，Praet N，Sammin D，et al.Foot－and－mouth disease non－structural protein serology in cattle：use of a Bayesian framework to estimate diagnostic sensitivity and specificity of six ELISA tests and true prevalence in the field［J］.Vaccine，2007，25（41）：7177－7196.DOI：10.1016/j.vaccine.2007.07.023