鸭源大肠杆菌氨基糖苷类耐药基因的检测与传播扩散机制

陈燕杰，裴亚玲，吴 华，潘玉善，刘建华，苑 丽，杜向党，孟春萍，胡功政

2.郑州牧业工程高等专科学校，郑州 450011

氨基糖苷类抗生素是治疗鸭大肠杆菌病的常用药物，近年来已陆续有鸭源大肠杆菌对本类药物耐药的研究报道［1］。氨基糖苷类修饰酶是肠杆菌对氨基糖苷类产生耐药性的重要原因。2003年，一种较新的由质粒介导的耐药机制—16S r RNA甲基化酶被发现，其可导致革兰氏阴性杆菌对氨基糖苷类药物高度耐药［2］。目前，已有6种16S r RNA甲基化酶基因在医学临床上相继报道，包括arm A、rmt A、rmt B、rmtC、rmt D和nmp A等［2－5］，可导致对几乎所有临床重要的氨基糖苷类抗生素的高水平耐药性［6－7］。16S r RNA 甲基化酶基因通常有质粒介导，能通过接合或转化进行传播和扩散［8］，且与可移动基因元件（插入序列、转座子）相关［9］。现已有人源、猪源、鸡源大肠杆菌中检测氨基糖苷类修饰酶基因的报道［10－11］，但迄今，对鸭源大肠杆菌氨基糖苷类耐药机制的报道相对较少，有关鸭源大肠杆菌16S r RNA甲基化酶基因的检测尚未见报道。本试验旨在检测分析氨基糖苷类修饰酶基因和16S r RNA甲基化酶基因及其基因环境，探讨耐药基因与耐药表型的相关性、耐药基因的传播扩散机制，为鸭大肠杆菌病防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株 保存鸭源大肠杆菌27株，2009年5月—2010年10月由本试验室从湖南、四川、江西、福建、山东、河南等地的病死鸭肝脏、心脏中分离，经培养特性、全自动细菌鉴定系统鉴定为大肠杆菌。大肠杆菌C600为质粒接合受体菌。

1.2 试验药品 庆大霉素（GM）、安普霉素（AM）、新霉素（NM）、硫酸阿米卡星（AMK）：均由河南牧翔动物药业有限公司提供。

1.3 培养基和试剂 MH肉汤、LB肉汤均购置广东环凯微生物科技有限公司；QIAGEN Plasmid MiniKit（QIAGEN公司），Taq Mix DNA（北京康为世纪有限公司）聚合酶、PCR试剂、DNA Markers，T4DNA连接酶、EcoRI均购自TaKaRa公司，琼脂糖，购自上海生工生物工程服务有限公司。

1.4 主要仪器 PCR仪，法国生物梅里埃VITEK－32全自动细菌鉴定仪，电泳仪，凝胶成像系统，电子分析天平，超净工作台，EBA21离心机，高压灭菌锅，恒温水浴摇床，96孔V型反应板等。

1.5 载体 p BluescriptⅡSK（＋）（本校微生物实验室惠赠）。

1.6 药敏试验 用试管二倍微量稀释法，测定氨基糖苷类代表药物庆大霉素、安普霉素、新霉素、阿米卡星对临床分离菌株的最低抑菌浓度（MIC）［12］。

1.7 氨基糖苷类耐药基因的检测 根据Gene－Bank公布的有关序列设计6对特异性引物，扩增arm A、rmt A、rmtB、rmtC、rmtD和npm A基 因，见表1。采用煮沸法提取DNA。反应体系：模板3 μL，25μmol/m L的上下游引物各1μL，双蒸水20 μL，Taq Mix DNA聚合酶25μL，总体积为50μL。反应条件：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，其中arm A和npm A的Tm＝52℃，rmt A和rmt D为63℃，rmt B为61 ℃，rmtC为56.5 ℃，72 ℃ 延 伸8 min。

另按文献报道的引物和条件扩增氨基糖苷类修饰酶基因［13］aac（3）－I、aac（3）－II、aac（3）－III、aac（3）－IV、ant（2’’）、aph A1、aph A2。

以灭菌双蒸水为阴性对照。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭染色，紫外投射仪下观察结果，凝胶成像系统摄像。代表性PCR产物，送上海生工生物工程公司测序，测序结果在NCBI BLAST上进行同源性分析。

1.8 质粒接合试验 以5株16S甲基化酶基因阳性的分离菌为供体菌，利福平耐药的大肠杆菌C600为受体菌，各取0.5 m L接种到5m L LB肉汤中混匀，37℃震荡培养5 h。以受体菌、供体菌为对照，在含利福平（300μg/m L）和阿米卡星（128μg/m L）的LB平板上筛选阳性接合子。按前述方法测定接合子的MIC、检测16S r RNA甲基化酶基因。

用QIAGEN质粒提取试剂盒提取供体菌与接合子质粒，0.7%的琼脂糖凝胶电泳，以大肠杆菌V517作为标准质粒Marker，用LambImage软件计算质粒大小，分析质粒轮廓（数量和大小）。

1.9rmt B的基因环境

1.9.1 p BluescriptⅡSK（＋）－rmtB重组质粒的构建 分别将两株接合子菌株CY1、CY2质粒和载体p BluescriptⅡSK（＋）质粒用EcoRI单酶切，两者酶切产物按1∶2进行粘末端连接反应。构建的p BluescriptⅡSK（＋）－rmtB重组质粒，CaCl2法克隆到DH5α感受态细胞，用 LB/Amp/AMK/X－gal/IPTG平板筛选阳性重组子，增菌后提取重组质粒。1.9.2 重组质粒的确认、靶基因的测序及分析 用EcoR I单酶切重组质粒，后1.2%琼脂糖凝胶电泳，以确证靶基因的正确插入及测定插入片段的大小。阳性重组质粒送上海生工生物工程有限公司用M13通用引物Primer Walking测序，把所得序列在NCBI进行Blast比对，并用DNAStar软件作同源性分析。

表1 PCR扩增及测序所用引物Tab.1 Primers used for the PCR amplification and sequencing

2 结 果

2.1 药敏试验 敏感性试验结果见表2，27株分离鸭源大肠杆菌中分别有23、19、19和18株对安普霉素、庆大霉素、阿米卡星、新霉素耐药，耐药及交叉耐药十分严重。

2.2 耐药基因的检测 16S甲基化酶基因 27株鸭源大肠杆菌中，rmt B基因阳性19株，检出率为70.4%，未扩出arm A、rmt A、rmtC、rmt D和npm A基因。rmt B基因与已报道的rmt B基因（JF910132.1）同源性达99%以上。序列测定结果已经登陆GenBank，并获得相应的序列号：JN387906。

氨基糖苷类修饰酶基因 仅6株检测出aac（3）－Ⅳ，检出率为22.2%。PCR产物所测序列（序列号：JN387905），与 GenBank：HQ380033.1同源性达95%以上。这6株同时携带aac（3）－Ⅳ和rmtB基因。

表2 27株分离菌的耐药表型Tab.2 Resistance phenotypes of 27 isolates

2.3 质粒接合试验 获得的5株接合子，全部检测出rmt B的阳性条带，均对4种氨基糖苷类药物高水平耐药（MIC≥128）。说明rmtB基因和对氨基糖苷类高水平耐药性可由质粒接合转移。

2.4 质粒轮廓分析 供体菌Y1、Y2分别有4个、2个质粒传递给对应的接合子CY1、CY2，质粒大小从3 kb到108 kb不等。Y1菌株有3个可见质粒，质粒数少于接合子CY1，可能是由于质粒提取过程DNA发生降解。

2.5 rmtB的基因环境 将阳性重组质粒p BluescriptⅡSK（＋）－rmtB用EcoR I单酶切后电泳，可见约4.5 kb的rmt B及其上下游目的片断（图1），载体片段为2 918 bp。测序后所得rmt B基因环境示意图见图2：rmtB上游是β－内酰胺酶编码基因blaTEM－1，下游为ISCRI转座酶基因。序列测定结果已经登陆GenBank，并获得相应的序列号：JQ941741。

3 讨 论

以往认为，细菌对氨基糖苷类药物耐药的主要机制是由于3种氨基糖苷修饰酶即磷酸化酶（aph）、乙酰化酶（aac）、腺苷化酶（ant）所产生。每种修饰酶又分为多种同工酶及其亚型，各亚型有不同的耐药表型，相同的表型还可由不同的基因编码［13］。但这些酶由于特异性的窄底物谱，其中任何一种都不能赋予细菌对所有氨基糖苷类药物的耐药性。据报道在耐氨基糖苷类的临床分离菌中，aac编码的耐药性约为5%～10%［11］。本试验中，aac（3）－Ⅳ基因是国内鸭源大肠杆菌中的首次检出。aac（3）－Ⅳ首先发现于人源耐庆大霉素的菌株中，主要编码对庆大霉素的抗药性，但不能导致对阿米卡星的明显耐药。aac（3）－Ⅳ的检出率仅为22.2%，远低于本类药物耐药率，显然aac（3）－Ⅳ并不是主要的耐药机制。

图1 pBluescriptⅡSK（＋）－rmtB重组质粒酶切结果M：DNA MarkerλEco T14Ⅰdigest；1：重组质粒pBluescrlptⅡSK（＋）－rmtB的EcoR I单酶切片段；2：载体pBluescrlptⅡSK（＋）的EcoR I单酶切片段；3：阴性对照.Fig.1 Digestation results of pBluescriptⅡSK（＋）－rmtB recombinant plasmidM：DNA MarkerλEco T14Ⅰdigest；1：Recombinant plasmid pBluescrlpt II SK（＋）－rmt B single fragment with EcoR I；2：pBluescrlpt II SK （＋）single fragment with EcoR I；3：Negative control.

图2 rmtB环境结构示意图Fig.2 Schematic diagram of rmtB environment

新出现的本类药物如阿米卡星经过功能基团的修饰，过去报道耐药率低［14］。但本次试验表明：鸭源大肠杆菌对其耐药率很高（70.4%），这可能与其在鸭病防治中长期不规范使用有关（该药在兽医临床并未批准使用）。本试验中rmt B基因的检出率（70.4%）与对阿米卡星的高耐药率一致，明显高于aac（3）－Ⅳ的检出率，说明rmt B基因在鸭源大肠杆菌中更为流行，阿米卡星的高耐药率显然主要与rmt B有关。27株鸭大肠杆菌中，6株携带aac（3）－Ⅳ基因的菌株均同时携带rmtB基因，因本次试验所选菌株较少，故只能代表部分地区新耐药基因的流行和多耐药基因的同时存在，是导致对氨基糖类高水平耐药和严重交叉耐药的重要原因。但分离菌对安普霉素的耐药率高于rmtB的检出率，说明仍存在其它耐药机制，有待进一步研究。

细菌借助可移动遗传元件（质粒、转座子和整合子等），通过水平转移获得耐药基因［15］。质粒接合是基因转移的重要过程，多数致病菌获得耐药性是通过接合完成的。本研究中，5株接合子都能检出可接合质粒和rmtB基因，并对四种药物呈高水平耐药，说明5株菌的rmt B均可通过质粒接合传递给受体菌，并使受体菌高水平耐药，导致高水平耐药性的传播和扩散。rmt B的上游是可介导对氨苄西林、阿莫西林耐药的blaTEM－1，下游是插入序列ISCRI，这表明blaTEM－1与rmt B位于同一质粒上，其接合传递可同时引起对氨基糖苷类、广谱青霉素类耐药的传播扩散，此外，下游的ISCRI在rmt B传播扩散中有重要作用。质粒的可传递性给耐药性传播的阻断和畜禽疾病的防治带来很大困难，故应进一步了解细菌群体中耐药质粒的分布状况，找出流行质粒并分析其分子特点，为有效地控制、预防耐药质粒的流行传播奠定基础。

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