复合酶提高黄柏水提效率的关键技术研究*

文洪宇 陈 曦 黄 彦 陈 玲 宋 健 杨雅淋 王 琴 张洪雷△

（1.重庆市中医研究院，重庆 400021；2.成都九芝堂金鼎药业有限公司，四川 成都 610101）

复合酶提高黄柏水提效率的关键技术研究*

文洪宇1陈 曦2黄 彦1陈 玲1宋 健1杨雅淋1王 琴1张洪雷1△

（1.重庆市中医研究院，重庆 400021；2.成都九芝堂金鼎药业有限公司，四川 成都 610101）

目的 探讨提高黄柏水提工艺效率的方法。方法 在黄柏水提工艺程序中，加入纤维素酶-果胶酶-半纤维素酶组成的复合酶，按均匀试验设计考察5因素10水平 ，用SAS8.2统计分析，测定过滤速度及水提液的浸出物变化作指标，考察酶解工艺条件。结果 每克黄柏取相当于酶活力1万U的纤维素酶，0.5万U的果胶酶，0.1万U的半纤维素酶，调温度37℃，pH为3.9的酶解条件下得到的黄柏水提液，分离速度提高5.64倍，黄柏碱与小檗碱收率分别提高2.17、1.14倍。结论 应用复合酶可提高黄柏水提工艺的生产效率。

复合酶 黄柏 水提工艺 分离提速

△通信作者

Research on Key Technology of Improvment on the Efficiency of Cortex Phellodendri Chinensis Water -fd

黄柏主要有效成分为季铵型生物碱，如小檗碱、黄柏碱、木兰花碱、掌叶防己碱、药根碱等［1］，均为水溶性生物碱，故目前提取黄柏生物碱的方法多采用水浸提法，主要是酸水法、石灰乳法、超声波提取等［2-3］。但由于黄柏皮性质坚韧，水溶剂不易穿透进入纤维素内部，细胞壁内有效成分溶出率不高，再有黄柏含大量黏液，黏液通常为具有分支结构的杂多糖，含黏液质的黄柏提取物制成的中药丸、片等，崩解时限不易合格，实际生产效率低。复合酶法有助于保持天然产物构象及成分原有性质，操作简便易行，保留原设备生产线，故本实验对复合酶改进黄柏水提工艺进行研究。

1 材 料

黄柏为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinense Schneid.的干燥树皮，药材来自重庆南川，由重庆桐君阁股份有限公司曾宪策主任中药师鉴定。实验用酶果胶酶活力210万U/g，半纤维素酶活力40万U/g，纤维素酶活力40.1万U/g，均由宁夏夏盛实业集团生产提供。

2 方 法

2.1 工艺路线选择据黄柏药材理化性质，结合酶特性［4］，检索文献资料，经预试筛选，确定提取工艺路线如图1。

图1 黄柏水提工艺路线

2.2 工艺条件研究本实验提取生物碱的方法包括酶促浸提和灭酶浓缩两个阶段。第1阶段主要作用是酶解细胞表面纤维、半纤维木质结构及黏液物，热水浸提利于生物碱的分离、溶出；第2阶段通过加热，既具有灭酶活的作用，同时又浓缩药材至规定量。

2.2.1 考察指标的选择 （1）浸出物含量测定：精密量取供试品续滤液10 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后于105℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定质量。以干燥品量计算供试品中浸出物含量作收率考察指标。（2）单位时间滤液量测定：药液以500 mL漏斗0.2 MPa真空抽滤，φ11 cm双层快速滤纸滤过，量取酶提取分离程序中20 min内通过的滤液总量，计算单位时间滤液量（mL/min）作为分离速度考察指标。

2.2.2 复合酶提取分离试验 根据酶特性，选择纤维素酶-果胶酶-半纤维素酶组合成复合酶［5］，加入到难滤皮类药材黄柏的水提工艺中，测定过滤速度及水提液的浸出物变化作指标，考察酶解工艺条件。酶解条件由于涉及因素水平多，根据文献报道、各相关酶使用要求及预试情况，按均匀试验设计考察5因素10水平，因素水平表见表1。实验以0.5%稀硫酸、5%Ca（OH）2水溶液调节pH值。黄柏粗粉加15倍水，加热温度、调节pH值到所需条件时，将酶按1∶10加适当温度的水稀释，缓缓加入到物料中搅拌均匀，恒温酶解，过滤。

表1 因素水平表

根据 U 11（11 10）的使用表选择 5 因素：1、2、3、5、7列。固定其他条件，改变5因素的水平，按均匀设计条件进行试验，并做重复试验2次，各实验批次的提取液，按考察指标“单位时间滤液量测定”项下含量测定方法测定，计算单位时间滤液量；按“浸出物含量测定”项下方法测定，计算浸出物收率。试验设计及结果见表2。

将5因素10水平数据规格化后进行计算，试验计算中由于各因素的复杂相关性，均匀试验软件不能单独处理，用SAS 8.2运算拟合，其中综合评分考虑指标重要程度及数量级差，权重系数分配为 单位时间滤液量与浸出物收率为1∶1。结果回归方程如下：Y=18.69+467.63C-416.92C2-72.34E2+123.71AD-56.38BC-24.64BE-58.45CD（R2=0.9995），根据相关系数，C 为最大影响因素。结合实际生产条件，y预测值在y最大预测值95%范围内，选较优规格化数据：A=1，B=0，C=0.49，D=0.89，E=0，y 预测值=232.33。

表2 试验设计及结果表

确定酶解条件为：酶解温度37℃，酶解时间180min，酸碱度为3.9，每克黄柏使用复合酶：1万U纤维素酶，0.5万U果胶酶，0.1万U半纤维素酶。

2.2.3 工艺条件验证 根据确定酶解条件，重复酶解程序操作，测定分离速度及黄柏碱、小檗碱含量；与未加酶常规热水提取操作比较，计算黄柏碱、小檗碱收得率和分离速度提高倍数。分离速度测定同2.2.1项下单位时间滤液量测定法操作。黄柏碱、小檗碱含量照2010版《中国药典》一部（附录Ⅳ D）高效液相色谱法一次进样测定。

色谱条件：色谱柱 C18（250 mm×4.6 mm，110 A），流动相为乙腈（A）-0.025mol/L磷酸二氢钠（含0.0125mol/L的十二烷基硫酸钠）（B），梯度洗脱，梯度洗脱程序为0～15 min，35%A-65%B；15～35 min，50%A-50%B，流速1.0 mL/min，柱温35℃，检测波长265 nm。分别精密称取盐酸黄柏碱、盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇溶解，制成混合对照品溶液（每毫升含盐酸黄柏碱0.13mg、盐酸小檗碱1.26 mg）。精密量取样品液0.4 mL，水浴蒸干，残渣以甲醇溶解稀释至于10 mL，制成供试品溶液。分别精密吸取上述对照品与供试品溶液5～20 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。工艺条件验证测定结果见表3。测定结果表明工艺可行。

2.3 制备工艺按处方量数倍称取检验合格的黄柏原生药饮片，粉碎成粗粉，备用；称取处方量黄柏，加15倍水浸润，调温度37℃，pH为3.9；另每克黄柏取相当于酶活力1万U的纤维素酶，0.5万U的果胶酶，0.1万U的半纤维素酶，加水10倍调匀，缓缓加入黄柏水浸液中，搅匀，保温180 min，200目筛过滤，滤液备用；黄柏药渣继续加10倍水，常规煎煮1 h，200目筛过滤，滤液合并，灭酶，浓缩至规定量（相当于生药1 g/mL）即得。

表3 工艺条件验证测定结果

3 讨 论

复合酶改进黄柏水提工艺与传统提取法相比，提取液澄清度和有效成分收率提高，提取温度接近人体温度，速度快，药材利用率高，降低了生产成本，不需增加生产线新设备投入，宜于大规模生产。

初步工艺路线在药材中直接加入酶液 （1∶10）拌匀，认为可减少酶用量，但实际操作中酶液加入到干物料中不易搅拌均匀，且整个程序待时较长。酶的专一性、特异性等特点，决定其酶用量与底物量相关，实际工艺中加入大量水浸润，药材与酶充分接触，提取过程中无需再搅拌。

［1］南京中医药大学.中药大辞典 （下册）［M］.2版.上海：上海科技出版社，2006：2822.

［2］尹蓉莉，杨军宣，李化，等.黄柏中盐酸小檗碱提取实验方法的改进［J］.基层中药杂志，2000，14（6）：27-29.

［3］国家药品监督管理局信息中心文献资料.超声提取黄柏中小檗碱成分的研究，中药制药技术与工艺汇编［M］.北京：化学工业出版社，2002：1.

［4］文洪宇，李洪，段砚.应用于中药提取分离中的酶的综述［J］.中国医药指南，2009，7（10）：203-205.

［5］文洪宇，李洪，杨娟，等.酶解技术在中药提取分离中的应用进展［J］.湖南中医药大学学报，2007，8（27）：352-354.

extraction by Composite Enzyme

WEN Hong-yu1，CHEN Xi2，HUANG Yan1，et al.1 Chongqing Academy o Traditional Chinese Medicine，Chongqing 400021，China；2 Chengdu Jiuzhitang-jinding Pharmaceutical Limite Company，Sichuan，Chengdu 610101，China

Objective:To study and improve the efficiency of the Cortex Phellodendri Chinensis water-extracting process.Methods:The process of Cortex Phellodendri Chinensis water-extraction was added in composite enzyme which comprises of“cellulose enzyme”-“pectinase”-“half of cellulose enzyme”，with the basis on the uniform experimental design investigating the 5 factors and 10 levels，with the SAS 8.2 statistical analysis.The filtration speed and water extraction fluid extract change index was examined enzyme solution process conditions.Results:Each 1g cortex phellodendri taking the enzyme activity was equivalent to 10000 U the cellulose enzyme，5000 U pectinase，1000 U half cellulose enzyme.The temperature was 37 ℃，pH 3.9 of enzyme solution obtained under such condition.The separating speed was increased by 5.64 times，cortex phellodendri alkali and berberine were ncreased yield 2.17，1.14 times.Conclusion:Application of composite enzyme can improve the Cortex Phelodendri Chinensis water-extracting process production efficiency.

Complex enzyme；Cortex Phellodendri Chinensis；Water-extracting technology； Separation speed

R285

A

1004-745X（2013）06-0898-03

重庆市中医药科技计划项目（2006-B-07）

2013-03-06）