针刺水沟、风府穴对急性大鼠脊髓损伤后前炎性因子表达的影响*

邹恩苗 王 赛 李江筎 蒋松鹤

（温州医学院附属第二医院，浙江 温州 325027）

针刺水沟、风府穴对急性大鼠脊髓损伤后前炎性因子表达的影响*

邹恩苗 王 赛 李江筎 蒋松鹤△

（温州医学院附属第二医院，浙江 温州 325027）

目的 观察针刺水沟，风府穴对大鼠急性脊髓损伤（SCI）后前炎性因子表达及神经细胞凋亡的影响。方法 雄性SD大鼠36只，随机分为假手术组、模型组、针刺组，采用实时荧光定量PCR法检测前炎性因子包括白介素-6（IL-6），白介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α） mRNA 的表达情况；用原位末端标记法（TUNEL）检测SCI后神经细胞凋亡情况，用HE及Nissle染色观察组织细胞形态变化。结果 SCI后8 h，模型组与假手术组比较受损伤的脊髓组织中模型组中前炎性因子mRNA表达水平显著升高，且TUNEL阳性细胞数增多，针刺组大鼠受损伤的脊髓组织中前炎性因子mRNA表达水平与TUNEL阳性细胞数较模型组均减少。结论 针刺水沟风府穴可降低大鼠急性SCI后脊髓组织中前炎性因子的表达及神经细胞凋亡的发生。

脊髓损伤 针刺 前炎性因子 凋亡

△通信作者

Effects of Acupuncture at Shuigou （GV26） and Fengfu （GV16） on the Expression of Pro-inflammation

脊髓损伤（SCI）及其再生机制是当今神经科学的研究热点，如何减轻SCI及其后的各种继发性损伤，促进被损伤神经纤维再生和上下行神经通路重建，备受相关学者关注，尤其是继发性损伤，更是研究的重点［1］。继发性损伤在脊髓损伤后数分钟就开始，可以持续数天，进一步导致脊髓的损伤和功能的缺失。近年来研究表明急性SCI后炎症相关基因表达增加，特别是在脊髓损伤后3～72 h［2-3］。针刺作为一种非药物疗法，具有疏经活络，调节脏腑气血平衡，促进神经功能恢复和神经再生的功效，而脊髓损伤后早期给予针刺

治疗具有促进神经功能恢复的作用［4～5］。本研究建立大鼠脊髓急性损伤模型，经针刺水沟风府穴治疗后观察脊髓组织神经细胞凋亡及前炎性因子IL-6，IL-1β和TNF-α mRNA表达的变化。

1 材料与方法

1.1 动物SD雄性大鼠36只，清洁级，体质量180～220 g，购自温州医学院实验动物中心，许可证号：SYXK（浙）2010-0150，分笼饲养。动物饲养环境温度20～25℃，湿度42%～50%。随机将大鼠分为假手术组、模型组和针刺组，每组12只。

1.2 模型制备SD大鼠经5%水合氯醛腹腔注射麻醉。将动物俯卧固定于自制大鼠手术台上，背部剃毛，常规消毒，以T10为中心，沿背部正中切开，切口长约2～3 cm，咬除T9～11棘突及全部椎板，暴露T10脊髓，使硬脊膜完整，通过 NYU Impactor［6］精确撞击，制作大鼠SCI（T10）中度损伤模型（10 g，25 mm）。 模型成功标志：脊髓打击部位瘀血，大鼠尾巴痉挛性摆动，双下肢躯体回缩样扑动，双下肢驰缓性瘫痪。损伤后逐层缝合切口，并消毒表面。术后独笼饲养，仔细护理。

1.3 干预方法实验大鼠固定于自制柔性大鼠固定器［7］。假手术组与模型组大鼠不做其他干预。针刺组于大鼠水沟、风府各刺入一毫针，针刺深度为1 mm，于脊髓损伤后30 min治疗及损伤后4 h后再治疗1次，治疗 30 min/次。

1.4 标本采集于大鼠损伤8 h后取材。动物麻醉后，经心脏升动脉先灌注37℃生理盐水300 mL冲洗组织内血液，继之灌注4℃4%多聚甲醛（pH7.4）200 mL固定组织，1 h后以损伤中心取脊髓，置4%多聚甲醛中4℃中过夜。然后梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋、切片。脊髓切片厚度4μm。以损伤区为中心取5mm脊髓置于无RNA酶的冻存管中放入液氮内速冻后转至-80℃超低温冰箱保存。

1.5 TUNEL原位末端标记法参照Roche公司Insitu cell Death Detection，POD试剂盒说明书进行操作，将脊髓组织切片常规脱蜡，脱水，20 μg/mL蛋白酶K 20 min，TUNEL反应复合物37℃水浴箱闭1 h后在荧光镜下观察，Convert-POD 37℃水浴箱闭光30 min，各步间均用PBS充分洗涤，DAB显色，苏木素复染后，光镜下观察及计算细胞凋亡指数。阴性对照：TUNEL反应复合物中不加入末端脱氧核苷酸转移酶，其他同上，镜下观察有无 TUNEL标记细胞。

1.6 HE及Nissle染色参照HE及Nissle试剂盒说明书进行操作，将脊髓组织切片常规脱蜡，脱水，染色，镜下观察组织细胞形态的变化。

1.7 实时荧光定量PCR相关试剂盒：TRIzol Reagent（invitrogen15596-026）、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit （Fermentas K1622）、荧光实时定量试剂盒 SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa Code：DRR420A）。IL-6引物序列如下：上游引物5'-AAGTTTCTCTCCGC AAGATACTTCCAGCCA-3'，下游引物 5'-AGGCAAAT TTCCTGGTTATATCCAGTTT-3'；IL-1β 引物序列如下：上游引物5'-GCAGCTACCTATGTCTTGCCCGTG-3'，下游引物 5'-GTCGTTGCTTGTCTCTCCTTGTA-3'；TNF-α引物序列如下：上游引物5'-CCCAGACCCTCACACTC AGAT-3'，下游引物5'-TTGTCCCTTGAAGAGAACCT G-3'。引物由上海生工生物工程有限公司合成。依据说明书，用TRIzol试剂提取脊髓组织总RNA，取1μg RNA以Oligo（dT）为引物反转cDNA备用。实时荧光定量PCR具体步骤参考ROCHE公司的SYBR Premix Ex TaqTM试剂说明书，GAPDH为内参照基因。每个样品设3个复孔，溶解曲线分析确保反应产物的特异性。不同组目的基因的表达差异基于其Ct值，进行统计学分析。

1.8 统计学处理应用SPSS16.0统计软件，计量资料以（±s）表示。 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 针刺对脊髓组织形态学的影响（1）HE染色。假手术组可见脊髓结构完整，灰白质边界清楚，可内见正常形态的神经元，核仁较大且居中（见图A1）。针刺组可见脊髓结构欠清晰，灰白质分界不清，出血坏死模型组轻，神经元残留，但染色模糊，结构不清（见图A2）。模型组可见脊髓结构破坏，中央区碎裂，灰质及白质广泛出血，灰质中可见缺损区，大量神经元核固缩，胞浆红染加深并有凋亡小体形成（见图A3）。（2）Nissle染色。假手术组脊髓尼氏染色见结构完整、清晰，神经元细胞数目多（见图B1）。针刺组介于上述二者之间，形态尚保留，胞质内染色减轻，呈颗粒状，神经元保留，但数目减少（见图B2）。模型组神经元形态不规则，数目明显减少。尼氏体的急剧减少（见图B3）。

图A 脊髓HE染色观察（×400）

图B 脊髓Nissle染色观察（×400）

2.2 针刺对脊髓神经细胞凋亡的影响在术后8 h，假手术组可见少量阳性细胞（见图C1）。针刺组可见阳性细胞数比模型组明显减少（见图C2）。模型组可见大量阳性细胞表达，白质及灰质中均可见（见图C3）。提示针刺能明显抑制脊髓神经细胞的凋亡。损伤8 h后模型组大鼠受损伤的脊髓组织中细胞凋亡指数较假手术组增高（P＜0.05），针刺组受损伤脊髓组织中细胞凋亡指数较模型组降低（P＜0.05）（见表 1）。

图C 脊髓TUNEL DAB染色观察（×200）

表1 各组细胞凋亡指数（%）

2.3 针刺对脊髓后 IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达的影响实时荧光定量PCR定量显示（见表2），损伤8 h后模型组大鼠受损伤的脊髓组织中IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达较假手术组明显增加 （P＜0.01），针刺组受损伤脊髓组织中IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达较模型组减少（P＜0.05）。

表 2 各组 TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA 相对表达量（±s）

表 2 各组 TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA 相对表达量（±s）

组 别 n TNF-α IL-1βIL-6假手术组 8 0.60±0.36△△ 0.77±0.40△△模型组 8 4.18±2.04 5.81±3.02 0.05±0.02△△6.05±2.83针刺组 8 2.31±0.75△ 3.87±2.66△3.70±2.17△

3 讨 论

脊髓损伤后，继发性损害是导致脊髓损伤难以恢复的关键因素之一，而继发性损害具有可逆性、可控性，是可以人为介入干预的，因此，通过各种治疗手段维持脊髓微循环稳定，抑制脊髓毒害因素，延缓或抑制存活的神经细胞进一步损伤是近年来研究重点［8］。近年研究认为针刺能减轻脊髓损伤后的继发性损伤，减轻和延缓急性脊髓损伤早期病理损害，改善脊髓微循环，以达到保护脊髓组织；促进受损脊髓合成和分泌内源性神经营养因子，促进脊髓下行纤维再生和脊髓功能恢复［9-10］。针刺选穴配穴方面［11］，水沟、风府穴均属督脉经穴，前者分布有敏感而易于传导强烈刺激的神经末梢，是休克状态下针灸急救的名穴；后者穴下深层为延髓区域，是临床治疗外伤性截瘫和脊髓型颈椎病的常用穴位。两穴相配，具有通泄督脉、开窍救急之功，可能对中枢神经系统损伤后超早期的炎性水肿反应有抑制作用［12］。已有研究表明水沟-风府针刺可以激活双侧大脑与运动相关的功能区，诱导与运动相关的神经组织兴奋，补偿或协助受损的神经网络的重建［13］，但对脊髓损伤治疗研究甚少。

有研究表明脊髓受外伤打击时，白质的损伤更多的是由于继发损伤所导致，神经元和神经腔质细胞死亡亦不是缘于直接损伤，而是继发细胞凋亡的结果［14］。本研究结果发现针刺水沟、风府后对大鼠脊髓损伤后的一些病理改变有显著改善，可减轻损伤部位片状出血及囊腔，组织疏松水肿，神经细胞肿胀等有所改变。因此，本实验结果在形态学提示针刺水沟、风府对损伤段脊髓的有一定的保护作用。

近年来的研究表明SCI后促发的局部炎症反应是导致SCI的重要机制［15-16］，其主要涉及血流动力学指标和血管通透性改变、水肿、白细胞浸润、血脑屏障破坏、炎性介质释放、转录因子及补体激活、急性期反应蛋白表达、粘附分子表达等病理过程。SCI的炎性反应主要包括两种成分：炎性细胞和以细胞因子为代表的炎性介质。其中，以TNF-α、IL-1β、IL-6为代表的前炎性细胞因子不仅作为效应分子在SCI后炎症反应中发挥重要作用［17］，而且常常作为炎症反应的信号分子，它们在损伤组织的表达水平往往可反映炎症反应的程度。抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等的过度表达以减轻炎症反应程度，发挥对SCI的治疗作用，已成了研究的重点。本研究结果显示，SCI后8 h模型组与假手术组比较，IL-6，IL-1β，TNF-α mRNA 表达明显增加，针刺水沟风府后电针治疗组受损伤脊髓组织中IL-6，IL-1β，TNF-α mRNA表达较模型组减少，因此推测，大鼠急性SCI后，针刺水沟、风府穴治疗可能是通过抑制受损伤脊髓组织表达致炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α，从而减轻脊髓损伤后炎症，促进脊髓损伤后神经功能的恢复。

有研究表明，脊髓损伤后前炎性因子表达的增高，与诱发神经细胞凋亡有关［18］。大鼠脊髓损伤4 h后，在损伤区内神经元中发现凋亡细胞，8 h达到高峰。神经胶质细胞中的凋亡细胞在伤后4 h出现，24 h达到高峰［19］。本研究结果显示，SCI后8 h模型组与假手术组比较，TUNEL阳性细胞数增多，针刺水沟风府后受损伤脊髓组织中TUNEL阳性细胞数较模型组减少，因此推测，大鼠急性SCI后，针刺水沟、风府穴治疗可能是通过抑制受损伤脊髓组织表达致炎因子IL-6，IL-1β，TNF-α，从而减轻脊髓损伤后细胞凋亡，促进脊髓损伤后神经功能的恢复。

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Cytokine after Spinal Cord Injury

ZOU En-miao，WANG Sai，LI Jiang-ru，et al. The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Zhejiang,Wenzhou 325027,China

Objective：To investigate the effect of acupuncture at Shuigou （GV26） and Fengfu （GV16） on neuronal apoptosis and the expression of pro-inflammation cytokine after spinal cord injury in rats.Methods：36 SD rats were divided into 3 groups:sham-operated group,model group,acupuncture group.The expression of TNF-a,IL-1β and IL-6 mRNA were detected by quantitative Real Time-PCR （qRT-PCR）.Apoptosis neuron was marked with terminal deoxynucleotidyl transferase-midiated deoxyuredine triphosphate-biotin nick end labeling（TUNEL） staining.Organizational changes in cell morphology were observed by HE and Nissle dyeing.Results：Comparing with sham-operated group,the expression of mRNA in model group was markedly increased in the injured spinal cord at 8h after injury,and there were more TUNEL-positive cells in model group than in shamoperated group.Compared with control group,acupuncture significantly reduced the expression of TNF-α,IL-1β and IL-6 mRNA,and decreased the number of TUNEL-positive cells.Conclusion:Acupuncture may inhibit the expression of expression of pro-inflammation cytokine and reduce neuronal cell apoptosis after SCI.

Spinal cord injury；Acupuncture；Pro-inflammation cytokine；Apoptosis

R245

A

1004-745X（2013）06-0883-04

浙江省自然科学基金课题（LY12H27002）；浙江省温州市科技局基金项目（Y20110069）

2013-02-18）