鸭坦布苏病毒高免卵黄抗体的研制

邹晓娟 （山东省乳山市徐家兽医站 264500）

自2010年4月份，鸭坦布苏病毒病在我国浙江、福建、广东、广西、江苏、山东、北京等主要养鸭地区陆续出现，该病毒可感染产蛋鸭、育成鸭和商品肉鸭，产蛋鸭发病表现为产蛋量严重下降，可从90%以上降至10%以内，严重的甚至绝产，患病后期出现神经症状，死淘率升高，剖检感染鸭可见明显的卵泡出血和变性；育成鸭和商品肉鸭发病出现神经症状，转圈，翻个站不起来，淘汰率在10%～30%，严重时可达到80%，剖检可见脑组织病变，脑膜水肿、充血。该病传播迅速、波及面广，几乎席卷了整个养鸭密集地区，给我国养鸭业造成了巨大损失[1,2]。目前，本病尚无有效的预防和治疗措施。高免卵黄抗体的治疗效果已在长期的临床实践中得到了认可，特别在鸡传染性法氏囊、鸭病毒性肝炎等禽病的治疗和预防中效果确实可靠，本试验尝试利用鸭坦布苏病毒灭活疫苗免疫试验鸡，制备高免卵黄抗体来治疗该病。通过雏鸭攻毒保护试验发现，本试验制备卵黄抗体具有良好的预防与治疗作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 鸭坦布苏病毒 由山东省农科院家禽研究所分离保存。

1.1.2 SPF鸡胚 由山东省农科院家禽研究所提供。

1.1.3 试验用鸡 由山东省威海市某蛋鸡场提供。

1.2 方法

1.2.1 鸡胚半数致死量(ELD50)和鸡胚最小致死量平均死亡时间(MDT)的测定 将鸭坦布苏病毒分别做10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7六个稀释度，经尿囊腔接种10d龄SPF鸡胚，0.1ml/枚，各5枚，接种后7d内观察鸡胚死亡情况，并用Reed-Muench法计算其ELD50。用灭菌生理盐水将鸭坦布苏病毒分别做10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7六个稀释度，每个稀释度经尿囊腔接种5枚10日龄SPF鸡胚，0.1ml/枚。接种后的鸡胚在37℃孵育7d，每天早晚各照胚1次，记录每组鸡胚的死亡时间。使所有鸡胚死亡的最高稀释度就是最小致死量(MLD)，MDT是MLD致死鸡胚的平均时间。

1.2.2 制备高免卵黄抗体 将鸭坦布苏病毒按100倍ELD50剂量、以绒毛尿囊膜的方式接种10日龄SPF鸡胚，收集死亡的鸡胚尿囊液和尿囊膜，混在一起，充分捣碎，冻融3次后离心取上清，甲醛灭活后制成油苗。疫苗免疫：200日龄试验蛋鸡10只，第1次免疫油苗，0.5ml/只；间隔7d进行第2次油苗免疫，1ml/只；再间隔10d进行第3次油苗免疫，2ml/只，第3次免疫后15d开始拣蛋，通过鸡胚中和试验测定其卵黄抗体效价。

1.2.3 鸡胚中和试验测定卵黄抗体效价 收集第3次免疫后15d的免疫蛋，用灭菌生理盐水将卵黄分别做101、102、103、104、105、106倍稀释，分别与100倍ELD50的鸭坦布苏病毒混合，37℃作用1h，接种10日龄SPF鸡胚，0.2ml/枚，各5枚，同时设病毒对照组和102倍稀释的阴性卵黄对照组，7d内观察鸡胚死亡情况，并用Reed-Muench法计算卵黄抗体中和效价。

1.2.4 雏鸭攻毒保护试验 将30只3日龄的雏鸭分成3组，10只/组：预防组：先经颈部皮下注射高免卵黄抗体，0.5ml/只，24h后经腿部肌肉注射103ELD50的鸭坦布苏病毒；治疗组：先经腿部肌肉注射103ELD50的鸭坦布苏病毒，12h后颈部皮下注射高免卵黄抗体，0.5ml/只；攻毒对照组：经腿部肌肉注射103ELD50的鸭坦布苏病毒。观察并记录雏鸭存活情况，并对死亡雏鸭进行剖检。

2 结果

2.1 鸡胚半数致死量和最小致死量平均死亡时间

采用OIE规定的方法[3]对鸭坦布苏病毒进行毒力检测，结果显示，该病毒的鸡胚ELD50为105.32/0.1ml，鸡胚最小致死量平均死亡时间为107.5h。

2.2 卵黄抗体中和效价

不同卵黄稀释度条件下鸡胚存活情况见表1。根据鸡胚存活情况，用Reed-Muench法计算卵黄抗体中和效价为1:103.5。

表1 接种7d内鸡胚存活情况

2.3 卵黄抗体保护雏鸭试验结果

攻毒12h内有部分雏鸭出现死亡，去除这部分雏鸭，其余雏鸭120h内存活情况见表2。结果表明，预防组的保护率达到90%，治疗组的保护率达到78%。

表2 攻毒120h后各组雏鸭存活情况

3 小结

鸭坦布苏病毒属于黄病毒科黄病毒属，该病最早于2010年4月份发生在我国浙江、福建等地，随后几个月内迅速蔓延到广东、广西、江苏、山东、北京及东北地区，给我国的养鸭业造成了巨大的经济损失。随后几年该病在我国许多养鸭地区均有流行，已经成为一种常见病、多发病。由于国内外对黄病毒感染尚缺乏有效的治疗药物和治疗措施，因此目前鸭坦布苏病毒病还没有确实有效的治疗方法。临床上大多通过补充维生素和微量元素、后期通过饮水给以适当的抗生素防治细菌继发感染、加强饲养管理等措施进行治疗，但效果不佳[4～5]。特异性高免卵黄抗体对许多禽病的治疗具有良好的效果，因此笔者尝试利用卵黄抗体来治疗鸭坦布苏病毒病，探究这种治疗方法的可行性和有效性。由于鸭坦布苏病毒不同分离株之间无明显的抗原差异，因此只选择了一株病毒进行浓缩后制备了灭活疫苗，免疫产蛋试验鸡，经3次免疫后，收集免疫蛋，经测定其中和效价高达103.5，说明成功制备了鸭坦布苏病毒高免卵黄抗体。

通过雏鸭攻毒保护试验，发现本试验制备的卵黄抗体具有良好的预防和治疗鸭坦布苏病毒病的作用，预防组的保护率达到90%，而治疗组的保护率达到78%。这说明利用卵黄抗体来预防和治疗鸭坦布苏病毒病是可行的，其进一步的疗效还需要在实践生产中加以验证。

[1]滕巧泱, 颜丕熙, 张旭等.一种新的黄病毒导致蛋鸭产蛋下降及死亡[J].中国动物传染病学报, 2010, 18(6): 1-4.

[2]李玉峰, 马秀丽, 于可响等.一种从鸭新分离的黄病毒研究初报[J].畜牧兽医学报, 2011, 6: 885-891.

[3]世界动物卫生组织.诊断试验和疫苗标准手册[M].北京: 中国标准出版社.2004.

[4]胡旭东, 路浩, 刘培培等.我国发现的一种引起鸭产蛋下降综合征的新型黄病毒[J].中国兽医杂志, 2011, 7: 43-47.

[5]万春和, 施少华, 程龙飞等.一种引起种(蛋)鸭产蛋骤降新病毒的分离与初步鉴定[J].福建农业学报, 2010, 25(6): 663-666.