酿酒酵母ptc1缺失株在含盐培养基中的表型试验

李微微 （黑龙江省七台河市畜牧兽医局 154699）

酿酒酵母是一种重要的模式生物[1]，具有广泛的科研应用价值。Nelson等研究表明,酵母的基因组中约有200多个基因与耐盐有关[6]。酿酒酵母细胞的生长、发育以及响应外界环境和压力变化都受到促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导途径的调控[7]。Warmka J等测量了在用渗透压处理前后的HOG1激酶的活性，结果显示Ptc1在酿酒酵母对环境的适应中起着重要作用[10]。本文研究目的是为了通过观察ptc1△缺失株在含有LiCL培养基中的生长情况，来考察PTC1基因在细胞壁完整性中的功能。

1 材料与方法

1.1 BY4741和ptc1△菌株复苏活化 取出冻存的酿酒酵母BY4741和ptc1△缺失株，用接种环在YPD培养基固体平板中划线，于30℃培养箱中培养。

1.2 不同浓度的培养基的制备 称取1.0g胰蛋白胨、2.0g葡萄糖、0.5g酵母抽提物、2.0g YPD琼脂粉于三角锥瓶中，加入预先配制的10ml 4M的LiCL溶液，再加入90ml蒸馏水溶解至清亮，即为含有终浓度为0.4M LiCL的YPD固体培养基。按照此种方法配制其他含不同浓度的LiCL YPD培养基。121℃高压灭菌20min后，无菌超净台中制备平板。

1.3 菌株划线培养 按照三线法，将BY4741和ptc1△缺失株在YPD+0.1M LiCl，YPD+0.2M LiCl，YPD+0.3M LiCl，YPD+0.4M LiCl平板上划线，同时以YPD平板做对照，划线后的平板倒置培养箱中，30℃下培养并观察记录结果。

2 结果

按照示意图所示，划线培养的菌株生长情况显示，ptc1△缺失株在含有0.1M和0.2M LiCl的YPD平板上的生长速度比野生型慢，但其生长情况大体上与野生型是一致的(图1、图2)。但是当LiCl的浓度上升至0.3M时ptc1△缺失株已经出现了明显的生长缺陷(图3)，而当浓度继续提高至0.4M时，这种浓度的LiCl对ptc1△缺失株已经有致死的毒作用(图4)。这说明如果菌株缺失掉PTC1基因将会使菌株对含盐环境的适应能力下降，ptc1△缺失株在含盐的情况下会出现生长缺陷。0.3M的LiCl是ptc1△缺失株的敏感浓度而0.4M的LiCl已经可以对ptc1△缺失株起到致死作用。

图1 BY4741和ptc1△缺失株在含有0.1 M LiCl的YPD平板(30)℃生长2d的情况

图2 BY4741和ptc1△缺失株在含有0.2M LiCl的YPD平板(30℃)上生长4d的情况

图3 BY4741和ptc1△缺失株在含有0.3M LiCl的YPD平板(30)℃上生长4d的情况

图4 BY4741和ptc1△缺失株在含有0.4M LiCl的YPD平板(30)℃上生长4d的情况

3 讨论

在酿酒酵母中MAPK级联调控系统至少调控6种不同的生理反应[8]。HOG途径是细胞在高盐等高渗透压的环境条件下通过在细胞内合成和贮存甘油来提高细胞内部的渗透压的一种途径[9]，Warmka J等研究发现PTC1基因被敲除后，在外界渗透压的诱导下，HOG1的活性会因为失去PTC1的阻抑作用而不断激增导致细胞的死亡。因此，我们的实验结果显示酿酒酵母ptc1△缺失株在氯化锂浓度达到0.3M时即出现明显的生长缺陷，这说明PTC1确实在酿酒酵母对渗透压的适应过程中起作用。

[1]刘擎, 余龙.酵母: 一种模式生物[J].生命的化学.2000, 20(2): 61-65.

[2]Nelson DE,Shen B,Bohnert HJ.Salinity tolerance-mechanisms,models and the metabolic engineering of complex traits[J].Genet Eng(NY), 1998, 20: 153-176.

[3]Haystead, TA, Weiel, DW, Litchfield, Y.Tsukitani, EJ and Krebs EG.Okadaic acid mimics the action of insulin in stimulating protein kinase activity in isolated adipocytes[J].Science, 1990, 265: 16571-16580.

[4]Warmka J, Hanneman J, Lee J, Amin D, Ota I.Ptc1, a type 2C Ser/Thr phosphatase, inactivates the HOG pathway by dephosphorylating the itogen-activated protein kinase Hog[J].Mol Cell Biol, 2001, 21: 51-60.

[5]Posas F, Saito H.Osmotic activation of the HOG MAPK pathway via stellp MAPKKK: scaffold role of pbs2p MAPK [J].Science,1997,276:1702-1705.

[6]Mapes, JamesOta, Irene M.Nbp2 targets the Ptc1-type 2C Ser/Thr phosphatase to the HOG MAPK pathway [J].2004, 23 (2): 302-11.