枇杷DXR基因的克隆及其在果实成熟过程中的表达分析

张玲　林顺权等

摘 要：【目的】为了解枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）1-脱氧木酮糖-5-磷酸（DXP）还原异构酶基因（DXR）的序列特点及其在果实成熟过程的表达特性，【方法】以不同类型枇杷品种‘早钟6号 （红肉） 和‘白玉（白肉）不同成熟阶段的果肉和果皮为试材，采用RT-PCR 结合RACE 法和qRT-PCR方法对DXR基因进行了克隆，并对其在枇杷果实成熟过程中的表达进行了分析，【结果】枇杷DXR基因的cDNA序列全长1 743 bp，编码473个氨基酸，蛋白质相对分子质量（Mw）为51 299.8 Da，等电点（pI）为6.52（GenBank 登录号：JX089590）。qRT-PCR分析表明，在枇杷果实成熟过程中，DXR在不同类型枇杷的不同时期表达不尽相同：在果皮中，‘早钟6号品种的DXR基因在果实成熟的各个阶段的表现为表达量较为稳定，而在‘白玉品种中，DXR基因的表达存在较为明显的先增加后降低的过程，其表达量在褪绿期达到最高。而在果肉中，无论是‘早钟6号还是‘白玉品种，DXR基因的表达从果实成熟过程中的未转色期到黄熟期表现为持续下降；到成熟期时，‘早钟6号品种的DXR基因存在明显的上调现象，而在‘白玉品种中则无此明显变化，【结论】DXR基因对于枇杷类胡萝卜素的合成没有限制作用，至少作用不明显。

关键词： 枇杷； 果实； DXR； 基因克隆； 实时荧光定量PCR

中图分类号：S667.3 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪04-0563-04

在植物体内，异戊基焦磷酸（IPP）是类胡萝卜素合成途径中第一个较为直接的前体物质，而类胡萝卜素的生物合成所需的IPP绝大多数都来自质体2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径[1]。1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶（DXR）基因能催化1-脱氧木酮糖-5-磷酸（DXP）先异构后还原转化成 MEP；DXP除了用于合成萜类物质之外，还可以用于非萜类物质维生素B1和维生素B6的合成，但DXP一旦经DXR转化形成的MEP只能再转化成萜类物质，因此，DXR活性的高低决定了DXP用于萜类物质合成的比例，从而对类胡萝卜素的合成起到十分重要的作用。DXR基因首先在拟南芥中报道[2]，随后Carretero-Paulet等[3]研究指出：DXR基因由单基因编码，可在多种组织中广泛表达。近年来，在长春花[4]、玉米[5]、金鱼草[6]、银杏[7]、橡胶[8]等多种植物中先后克隆出了该基因。

枇杷果实的主要色素是类胡萝卜素，其含量与组成赋予果实不同的颜色。我们通过对枇杷的DXR基因的克隆、序列分析，并结合实时荧光定量PCR 技术对不同类型枇杷果实成熟过程中果肉和果皮DXR表达量进行检测，初步明确DXR的表达规律，从而为研究枇杷类胡萝卜素的积累与DXR基因的表达之间的关系提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 枇杷总RNA的提取及DXR基因cDNA全长的获得 枇杷总RNA的提取参照张玲等[9]的方法。以‘早钟6号总RNA反转录产物为模板，进行PCR扩增。其中DXR基因保守片段的扩增引物参考金蓉[10]设计的引物。在获得DXR基因的保守片段之后，分别采用3' RACE方法扩增3' 末端序列，5' RACE采用同聚物加尾的方法进行。用天根公司的DNA回收纯化试剂盒对目的片段进行回收纯化，并与pMD19-T载体（TaKaRa）连接，转化E. coli DH5α，进行蓝白斑筛选。所有测序均由上海美吉生物有限公司完成。将所得保守片段、3' 和5' 片段序列进行拼接，重新设计特异引物，以‘早钟6号总RNA反转录产物为模板扩增DXR基因cDNA全长。表1示DXR基因克隆所用引物。

1.2.2 基因生物信息学分析 利用生物信息学软件BLAST比对分析，找出起始密码子、完整的开放阅读框、终止密码子、5' 非编码区、3' 非编码区和poly（A）尾巴；并通过DNAMAN软件，将核苷酸序列翻译成氨基酸序列，预测分析蛋白质基本理化性质，同时进行多重序列比对。

2 结果与分析

2.1 枇杷DXR基因的克隆和分析

将枇杷DXR基因全长及其推导蛋白质与GenBank 中的序列进行同源性比较，发现在氨基酸水平上，与玫瑰（AEZ53171.1）、毛果杨（XP_002318048.1）、 橡胶树（ABD92702.1）、蓖麻（XP_002511399.1）、葡萄（XP_002282761.1）、番茄（NP_001234553.1）、烟草（ABH08964.1）、金鱼草（AAW28998.1）、拟南芥（XP_002866510.1）等植物的氨基酸序列同源性都大于83%。其中与玫瑰（AEZ53171.1）DXR 同源性最高，为92%。

2.2 DXR基因在枇杷果实不同阶段的转录水平分析

3 讨 论

在转DXR 基因的拟南芥植株中，下调该基因表达引起了花斑、色素沉积减少和叶绿体发育缺陷；而上调基因表达则引起叶绿素、类胡萝卜素增加，还增加了非转基因植株所没有的紫杉二烯[11]。但不是所有植物 DXR 基因都与植物萜类物质合成有密切关系。在番茄果实成熟期间有的类胡萝卜素大量积累过程中，相关的DXR基因的 mRNA水平并没有显著变化，这说明番茄体内 DXR 基因对类胡萝卜素合成没有限制作用[12]。

本研究发现：在果皮中，‘早钟6号的DXR基因在果实成熟的各个阶段的表达量无明显的增加或降低现象，具体表现为表达量较为稳定，而在‘白玉中，DXR基因的表达存在较为明显的先增加后降低的过程，特别是转色期和褪绿期，其表达量均明显高于‘早钟6号品种，但到了果实成熟期，‘早钟6号和‘白玉果皮类胡萝卜素含量却无明显差异。而在果肉中，特别是在果实成熟期，与‘白玉相比，‘早钟6号 DXR基因有一个明显上调的现象，其相对表达量约为‘白玉的2倍左右，但不足以解释在果实成熟期‘早钟6号和‘白玉果肉类胡萝卜素含量相差达10倍之多。由此我们可以推论：DXR基因的对于枇杷类胡萝卜素的合成没有限制作用，至少作用不明显。Fu等[13]研究了不同类型枇杷‘洛阳青和‘白沙果实发育过程中的质体变化及质体脂结合蛋白基因（PAP）的表达情况，指出‘白沙枇杷果肉中不能形成正常的有色体是其类胡萝卜素含量低的原因，PAP可能在枇杷果实有色体形成和转换中起重要作用。‘早钟6号和‘白玉不同品种以及果皮和果肉类胡萝卜素的积累差异是否也与此有关，需要进一步验证。（本文图版见插4）

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