分子标记在马铃薯育种中的应用

田再民，封生霞，籍立杰，冯 琰，冯莎莎

（1.河北北方学院农林科技学院，河北 张家口 075131；2.怀来县农业推广学校，河北，张家口 075400；3.张家口市农业科学院，河北 张家口 075000）

传统的育种主要依赖于植株的表型选择，环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素都会影响表型选择。育种周期长、不能预见育种结果，一个优良品种的培育往往需要花费7～8年甚至十几年时间，随着分子标记在粮食、蔬菜及其他作物上的广泛应用，分子标记育种取得了长足的发展。与育种相关的遗传标记主要有4种类型：①形态标记，如马铃薯的叶型、抗TMV的矮黄标记等形态性状标记；②细胞学标记，以非整倍体、缺失、到位、易位等染色体数组、结构变异为基础的细胞学标记；③生化标记，利用基因的表达产物，如同工酶与贮藏蛋白，在一定程度上反映基因型差异；④分子标记，指DNA标记，是以DNA多态性为基础，有以下优点：表现稳定，多态性直接以DNA形式表现，无组织器官发育期特异性，不受环境条件、基因互作影响；数量多，遍及整个基因组；多态性高，对目标性状表达无不良影响，与不良性状无必然连锁；部分标记遗传方式为共显性，可鉴别纯合体与杂合体，随机分布在基因组内，具有代表性［1］。

1 分子标记的原理和方法

RFLP标记，即限制性片?段长度多态性，始于1974年Grodzicker等［2］，80年代开始应用于植物。是最早应用于分子图谱构建、基因定位的分子标记。其原理是基因组DNA经限制性酶酶切产生不同长度片

1.1 RFLP标记

段的DNA，应用凝胶电泳技术，将不同大小的DNA片段分开，再经Southern印迹转移到尼龙膜上，与经过放射性同位素或生化试剂标记的DNA探针进行杂交，通过自显影显示出与探针杂交的特定DNA片段。此标记结果比较稳定，可以提供标记位点完整的遗传信息。但RFLP标记所需DNA量大，检测步骤复杂，费时费力。目前，RFLP标记直接用于育种成本高，人们正致力于将RFLP标记转化为PCR标记，便于应用。

1.2 RAPD标记

RAPD标记是由Williams和Welsh［3］在1990年研究的一种标记，称为随机扩增多态性DNA。是以植物基因组DNA为模板，一段随机的短的寡核苷酸序列作为引物，通过PCR扩增出多个片段的DNA，然后经凝胶电泳把DNA片段分开后形成多态性。RAPD分析所需DNA样品少，实验设备要求简单，分析样品较大。但该技术最大的缺点是重复性不好，所得标记是显性标记，不能区别显性纯合体与杂合体，它的应用在一定程度上受到了限制。

1.3 AFLP标记

AFLP是1993年建立起来的一种检测DNA多态性的方法，即扩增片段长度多态性［4，5］。其原理是对植物基因组DNA用限制性内切酶进行切割，然后将人工合成的双链接头连到酶切片段末端，再进行PCR扩增 （利用与接头互补的特异引物），将扩增产物进行凝胶电泳。AFLP技术结合了RFLP和PCR的优点，快速简单、稳定性强、DNA用量少。AFLP技术广泛应用于遗传图谱构建、基因定位、指纹图谱的建立等研究中。

1.4 SSR标记

1982年Hamada［6］等人发现。所有真核基因组中均含有一类DNA碱基序列，被称为微卫星或简单重复序列 （SSRs）。微卫星标记是一类由1-6个碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列。对模板DNA进行PCR扩增，利用非重复核苷酸序列设计的引物，所检测的DNA核苷酸序列的多态性片段为SSR标记。SSR标记可鉴别出杂合子和纯合子，重复性高，稳定可靠，但开发成本较高，为共显性标记。

1.5 ISSR标记

1994年由Zietkiewicz等发现的一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记。是以SSR标记为基础而开发的。其原理是用两个相邻SSR区域的引物，扩增单拷贝序列，电泳检测其产物的多态性。引物设计采用二个核苷酸、三个或四个核苷酸序列为基元。ISSR标记结合SSR和RAPD的优点，为显性标记，稳定性和多态性较好。

1.6 SCAR标记

1993年，Panran等［7］提出了一种将RAPD标记转化成特异序列扩增区域标记，即SCAR标记。其原理是目的基因经RAPD分析后，将多态性片段克隆，对克隆片段进行测序，根据测序结果，引物设计长为18～24nt，原来的RAPD扩增所用的引物在引物前10个碱基中包含部分。SCAR标记所用引物长，特异性扩增重复性好，可有效用于分子育种。

1.7 STS标记

STS标记即序列标记位点，1989年华盛顿大学的Olson等［8］人界定一段长度为200～500bp的序列的位点。STS一般为共显性或显性标记，在基因组中只出现一次。单拷贝的多态性DNA序列可以作为基因组的界标转化为STS标记。它容易在不同组合的遗传图谱间进行转移、重复性好、有较高的可靠性。但STS标记的开发依赖于序列分析以及引物合成，目前成本太高。现在，将PCR扩增产物经不同的限制性酶酶切后再进行电泳，检测其多态性，将STS标记转化成CAPS标记。

1.8 SNP标记

Lander E［9］于1996年提出的第三代DNA遗传标记，即SNP标记。是同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基的变化，表现为基因组核苷酸水平上的变异，包括单碱基的转换、颠换、插入、缺失等。SNP可分为编码区与非编码区SNP。有的SNP可产生不同的mRNA折叠方式，使mRNA合成、运输、成熟、翻译或降解过程中相互作用的细胞组分发生变化，最终导致生物功能的变化［10，11］。非编码区的SNP有的与调节基因的作用相关，有的则没有关系。SNP标记由于标记数目多，随着人类对拟南芥、水稻等全基因组测序的完成，以及DNA芯片技术的日趋成熟，将具有广泛的应用前景，作为一种较理想的DNA标记，受到越来越多的重视。

2 分子标记在马铃薯育种中的应用

2.1 遗传图谱的构建

遗传图谱的构建是植物遗传育种的依据。高密度的遗传图谱是育种家追求的理想图谱。遗传图谱构建的环节为：依据遗传材料之间的多态性来确定亲本，建立作图群体；作图群体中不同个体的基因型进行分析；应用计算机的程序来构建连锁群。选择合适的亲本杂交及分离群体直接关系到建立图谱的难易程度，是构建理想的遗传图谱的关键。若亲本间的差异太大会降低后代群体的结实率及影响图谱的准确性。遗传图谱主要应用于植物基因组的结构、进化、功能、数量性状、质量性状基因的定位等方面［12］。

中国关于马铃薯分子遗传图谱的研究较少。马铃薯所有的遗传图谱研究都在二倍体水平进行。1988年，Merideth W B构建了第一张马铃薯RFLP图谱［13］，后来几十张马铃薯分子连锁图谱公开发表。1992年又构建了一个密度更大的马铃薯RFLP图谱。德国C.Gebhardt小组以马铃薯基因组随机拷贝、cDNA和已知马铃薯基因为探针，构建总长690cM，包含141个位点的马铃薯RFLP分子连锁图谱［14］。1995年，Van Eck等［15］建立了二倍体马铃薯的高密度的AFLP遗传连锁图谱。AFLP是作图效率最高的标记［16，17］。1991年，Rouppevander Voort等［18］利用5个远缘二倍体绘制了连锁图谱，其中包含733个AFLP标记。同时他们用2个回交群体构建总长度为1034cM，包括340个RFLP标记和一个形态标记的分子图谱［19］。2001年，Chen等［20］建立了第一个马铃薯功能图谱，包含69个基因，其中还有85个位点。通过功能图谱与薯块淀粉含量、新陈代谢QTL图谱之间的比较，分析出一些与淀粉含量相关的候选基因。2001年，Luo等［21］建立了包含两个同源四倍体亲本及其后代群体的由SSR、AFLP标记组成的分子连锁图谱，为马铃薯的数量性状分析提供了方法。目前，中国在马铃薯农艺性状和品质性状基因定位研究方面还有待进一步加强。

2.2 重要性状的基因定位

把具体的基因定位到染色体的特定位置上，指的就是基因定位。根据样品的来源，有两种常用的基因定位方法。第一，分离群体分群分析法。1991年，Michelmore等［22］提出了群体分离分析法，通过分析两池内DNA的多态性，可获得与目的基因连锁的分子标记。具体方法是选择亲本进行杂交，但是表型性状应该有一定的差异，通过F1代自交获得性状分离的F2群体，从F2群体的小群体中随机取一定数量的个体，提取群体DNA，然后等量进行混合，形成两个基本相同的DNA池。第二，近等基因系法。是两个亲本杂交，亲本间目标性状有差异，F1代与轮回亲本多次回交后再自交获得。该系其余基因大部分同轮回亲本相同，多次回交耗时长。对近等基因系、轮回亲本的DNA或同工酶进行多态性分析，找出两基因组产物的差异，并以此为标记构建遗传图谱，对目标性状定位。AFLP技术可检测出DNA样品间的差别，适合于与近等基因系或BSA分析相结合，寻找与目标基因紧密连锁的分子标记，并构建目标基因所在区域的精细遗传图和物理图。

德国的Meksem等［23］利用F1群体及AFLP标记，检测到位于第5号染色体上的与马铃薯抗晚疫病紧密连锁的标记。Bendahmane等［24］利用AFLP标记定位与Rx基因相距123cM的AFLP标记。郜刚等［25］对两个马铃薯二倍体群体ED和CE共140个基因型进行青枯病人工接种鉴定，利用这种作图群体进行BSA分析，对抗性基因进行筛选和定位，结果筛选到与抗病感病性状基因定位在染色体XII上，与其相连锁的标记为3个RAPD标记OPG05940、OPR11800和OPO13770，一个SSR标记STM0032；检测到与抗病性相关的7个AFLP多态性条带，并为已有图谱上的共性AFLP标记，这些标记可用于马铃薯分子育种。

随着分子标记技术的发展，将复杂的数量性状分解为单一的遗传组分，用单基因的效率来处理这些性状，对数量性状基因位点 （QTL）作图，将数量性状基因绘制在连锁图上，找到与其紧密连锁的分子标记。Bradshaw等［26］分析了对囊线虫两个四倍体亲本及78个杂交后代，找到AFLP标记与双显性抗虫主基因的QTL紧密连锁，并定位于二倍体SSR遗传图谱中的第Ⅳ条染色体上，Rouppe等［27］将抗囊线虫的主基因定位于Ⅻ号染色体上。Collins等［28］对马铃薯晚疫病抗性基因进行了QTL分析。

2.3 种质资源研究

DNA指纹库在粮食、经济、蔬菜作物育种中的应用都十分广泛，分子标记可以用来建立DNA指纹库。多态性标记在同一物种的不同品种间大量存在，某一特定品种应该具有区别于其他品种的特定标记，这些特定的标记就是一些特异性DNA片段的组合，称为该品种的 “指纹”，各品种的特定的指纹片段构成该物种的DNA指纹库。

测定亲本间的遗传距离、确定亲缘关系是杂交育种亲本选配考虑的一个重要因素。分子标记特点就是受环境因素影响比较小，利用分子标记可以快速鉴别亲本之间的亲缘关系。根据种质资源DNA指纹的多态性，可对育种材料的变异程度作出具体评价。AFLP技术适合鉴定特定品种DNA指纹，它可以在较短的时间内检测出大量的多态性标记。Gregor等［29］建立了39个马铃薯栽培种的四种指纹图谱，包括RAPD、AFLP、SSR和ISSR指纹图谱，其中AFLP的效率最高，通过一次反应获得的多态性条带最多。Milbourne等［30］利用AFLP技术分析多种四倍体马铃薯栽培种的遗传关系。Knapova等［31］利用AFLP方法分析了134个晚疫病生理小种的表型和基因型结构。AFLP技术还被应用于马铃薯病原菌的研究。

作物品种包括具有较高的纯度的F1代杂交，通过检测品种是否具有其特有的标记指纹片断，可以有效对种子质量进行监测，来鉴定该品种纯度。2001年，国际马铃薯中心指出，用不同的分子标记，可以减少遗传冗余材料，增强马铃薯各品种保存的可靠性，并鉴定重要的马铃薯材料以利于保存和提高。利用分子标记对马铃薯的栽培种进行分析，结果显示SSR标记比ISSR标记更可靠和稳定，而ISSR标记比RAPD标记有更大的多态性和稳定性，研究表明使用3对SSR引物可区分50份马铃薯栽培种。Bryan等［32］将与野生种马铃薯抗孢囊线虫基因QTL定位在第Ⅴ连锁群，采用的是AFLP标记。Barone等［33］应用AFLP技术对马铃薯四倍体体细胞进行分子鉴定，结果提高了鉴定的效率和准确度。

3 展 望

马铃薯为无性繁殖作物，是四倍体遗传。分子标记技术在马铃薯遗传育种有广阔的应用前景。如分子标记辅助选择、基因的定位、基因的分离等方面。前人在马铃薯中目标基因的标记、遗传图谱的构建与种质资源的研究等方面作了大量工作，然而还存在着一些不足，比如：开发的分子标记数量少，通过实验，不容易发现与目标基因紧密连锁的分子标记，需构建更为精密饱和的遗传图谱；检测结果会有一些偏差（分子标记技术本身的局限性）；马铃薯的基因克隆有待突破。传统育种需要与分子标记的有机结合，要在大田中验证分子标记的结果和效应。

［1］张天真.作物育种学总论［M］.中国农业出版社，2007，6：278.

［2］Grodzicker T.Cold spring harbor symp［J］.Quant Biol，1974，39：439-446.

［3］Willams J G K，Kubelik A R，Livak K J，et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers［J］.Nucl Acid Res，1990，（18）：65312-65351.

［4］翁跃进.AFLP一种 DNA分子标记新技术［J］.遗传，1996，18（06）：29-31.

［5］Treuren R V.Efficiency of reduced primers selectivity and bulked DNA analysis for the rapid detection of AFLP polymorphisms in a range of crop species［J］.Euphytica，2001，117：27-37.

［6］Hamada H.A novel repeated element with Z-DNA-forming potential is widely found in evolutionarily diverse eukaryotic genomes［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1982，79：6465-6469.

［7］Paran I，Michelmore R W.Development of reliable PCR-based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce［J］.TAG，1993，85：985-933.

［8］Olson M V，Hood L，Cantor C，et al.A common language for physical mapping of the human genome［J］.Science，1989，245：1434.

［9］Lander E S.The new genomics：global views of biology［J］.Science，1996，274（5287）：536-539.

［10］曾燕如，黄敏仁.一种新的分子标记单核苷酸多态性（SNP）［J］.南京林业大学学报，2003，27（03）：84-88.

［11］Ponomarenko J V，Merkulova T I，Vasiliev G V，et al.rSNP-Guide，a database system for analysis of transcription factor binding to target sequences：application to SNPs and site-directed mutations［J］.Nucl Acid Res，2001，29（01）：312-316.

［12］李爱丽，马峙英.AFLP分子标记与作物改良［J］.河北农业大学报，2001，24（01）：89-94.

［13］Onierbale W，Meridet H，Robert L P，et al.RFLP maps based on commonest of colenes reveasmodes of chromosomal evolution in potato and tomato［J］.Genetics，1988（120）：10952-11031.

［14］Gebhardt C，ERitte R.RFLP maps of potato and their alignment with the homologous tomato genome［J］.TAG，1991（83）：492-571.

［15］Van Eck H J，Vandervoort J R，Draaistra J，et al.The inheritance and chromosomal localization of AFLP markers in non inbred potato offspring［J］.Mol Breed，1995，1：397-410.

［16］Jacobs J M E，Van Eck H J，Arens P F P，et al.A genetic map of potato（solanum tuberosum）integrating molecular makers，including transposons，and classified markers［J］.TAG，1995，91：289-300.

［17］邸宏，陈伊里.AFLP技术在马铃薯育种中的应用［J］.中国马薯，2004，18（02）：98-102.

［18］Van der Voort J N R，Van Zandvoort P，Van Eck H J，et al.Locus specificity of AFLP markers used to align genetic maps from different potato genotypes［J］.Mol Genet，1997，255：438-447.

［19］Gebhardt C，Eritte.RFLP analysis and linkage mapping solanum tuberosum［J］.TAG，1989（78）：652-751.

［20］Chen X，Salamini F.A potato molecular-function map for carbohydrate metabolism and transport［J］.TAG，2001，102（2／3）：284-295.

［21］Luo Z W，Hacket C A.Construction of a genetic linkage map in tetraploid species using molecular markers［J］.Genetics，2001，157：1369-1385.

［22］Michelmore R W，Paran I.Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregate analysis：A rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1991，88：9828-9832.

［23］Meksem K，Leister D，Peleman J，et al.A high-resolution map of the vicinity of the R1locus on chromosome V of potato based on RFLP and AFLP markers［J］.Mol Genet，1995，249：74-81.

［24］Bendahmane A，Kanyuka K，Baulcombe D C.High-resolution genetical and physical mapping of the Rx gene for extreme resistance to potato virus X in tetraploid potato［J］.TAG，1997，95（1-2），153-162.

［25］郜刚，屈冬玉.马铃薯青枯病抗性的分子标记［J］.园艺学报，2000，27（01）：372-411.

［26］Bradshaw J E，Hackett C A，Meyer R C，et al.Identification of AFLP and SSR markers associated with quantitative resistance toGloboderapallida（Stone）in tetraploid potato with a view to marker-assisted selection［J］.TAG，1997，97：202-210.

［27］Van der Voort J R，Wolters P，Folkertsma R，et al.Mapping of cyst nematode resistance locus Gpain potato using a strategy based on comigrating AFLP markers［J］.TAG，1997，95：874-880.

［28］Collins A，Milbourne D，Ramsay L，et al.QTL for field resistance to late blight in potato are strongly correlated with maturity and vigor［J］.Mol Breed，1999，5：387-399.

［29］Gregor C E，Lambert C A.A comparative assessment of DNA fingerprinting techniques（RAPD，ISSR，AFLP and SSR）in tetraploid potato（SolanumtubersumL.）germ plasm［J］.Euphytica，2001，13（02）：135-144.

［30］Milbourne D，Meyer R，Bradshaw J E，et al.Comparison of PCR-based markers systems for the analysis of genetic relation ships in cultivated potato［J］.Mol Breed，1997，3：127-136.

［31］Knapova G，Schlenzig A，Gisi U，et al.Phenotypic and genotypic structure ofPhytophthorainfestanspopulations on potato and tomato in France and Switzerland［J］.Plant Path，2002，51：641-653.

［32］Bryan G，Mclean K，Bradshaw E，et al.Mapping QTLs for resistance to the cyst nematodeGloboderapallidaderived from the wild potato speciesSolanumvernei［J］.TAG，2002，105：68-77.

［33］Barone A，Ritter E，Schachtschabel U，et al.Evidence for tetrasomic inheritance in a tetraploidSolanumcommerson（＋）S.tuberosumsomatic hybrid through the use of molecular markers［J］.TAG，2002，104：539-546.