分子生物学技术在微生物检验中的应用研究进展

路则宝，白现广

（1.楚雄医药高等专科学校，云南楚雄 675005；2.平顶山学院，河南平顶山 467099）

分子生物学技术是21世纪主导技术之一，它的发展大大拓宽和深化了微生物检验技术的发展，使医学工作者能从DNA、RNA水平上对病原微生物进行检测.其中聚合酶链反应（plolymerase chain reaction，PCR）作为体外核酸扩增技术在病原微生物的检测和鉴定、病毒基因的快速诊断、肿瘤基因的筛查等方面广泛应用.核酸探针技术以其敏感、特异、快速等特点已应用于病原菌的检测.生物芯片（bio- chip）技术也以其特有的高通量、多信息量、可快速同时检测多种待检样品的特点在病原菌的检测方面具有独特的优势[1].现对PCR、核酸探针和生物芯片等分子生物学技术在微生物检验中的最新应用研究进展进行综述，以期为相关的研究提供有价值的参考.

1 PCR技术

PCR技术在微生物检验中最有价值的应用领域就是对病原微生物的检测.通过在同一反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物进行扩增，可用于多种病原微生物的同时检测或鉴定出是哪种病原微生物感染[2].我国20世纪90 年代中期，PCR 技术已经广泛地用于检测感染性病原微生物，如人类免疫缺陷病毒（HIV），肝炎病毒（HBV）、HCV、性病致病菌等病原菌的检验[3]，现在PCR 技术也已经应用于检测鉴定分枝杆菌和检测结核杆菌耐药基因[4]，近几年来令全球恐慌的禽流感的致病病毒的检测也采用了PCR手段[5].

PCR技术具有快速、灵敏、准确的优点，只要样本中有一个病原体存在，在理论上，通过PCR就可以检测到.PCR技术不受混合标本的影响，可轻易从含有大量正常菌群的标本中鉴定病原菌[6]，而且对于一些不易分离培养，生长缓慢或不能人工培养，血清学方法不能明确或者检测灵敏度底的病原菌，比如分支杆菌、幽门螺杆菌、支原体衣原体、螺旋体、大多数病毒等，应用PCR技术则具有独特的优势[7]，因此PCR技术在病原微生物检测和鉴定方面有着广阔的应用前景.

当然常规 PCR技术也存在很多的问题，如出现假阳性、形成引物二聚体、传统的PCR技术一次扩增只能检测一种微生物、RNA病毒的PCR检测操作繁琐，中间污染环节多，易出现假阳性或假阴性结果等.为了弥补上面这些不足，一些新的PCR技术逐渐衍生出来并被用于实践，如热启动PCR、巢式PCR、逆转录PCR、多重PCR、通用引物PCR、PCR单链构象多态性分析、随机引物DNA 多态性扩增（RAPD）、限制性长度多态性分析（RFLP）、实时荧光PCR（real-time PCR）等[8].

综上，PCR技术将来有可能完全改变微生物检验的发展，使微生物检验发展为分子水平上的确诊，而不再局限于外部形态结构和生理特性等一般检验.

2 核酸探针技术

核酸探针是指带有标记的特异DNA片段，根据碱基互补配对的原则，核酸探针能特异的与目的DNA杂交，最后再用特定的方法测定标记物.探针标记的方式分为放射性标记和非放射性标记，目前用的较多的是非放射性标记，主要有生物素标记、地高辛标记、免疫标记、荧光素标记等几种，具有直观、准确的特点[9].应用较广泛的生物素-抗生物素蛋白系统标记的探针已在沙门氏菌、产肠毒素大肠杆菌及乙型肝炎病毒检测中得到应用.

目前核酸探针在微生物检验领域的应用主要在以下几个方面：用于检测无法培养、不能进行生化鉴定、产生不可观察的微生物产物以及缺乏诊断抗原等病原体的检测；用于检测病毒病，如检测肝炎病毒；用于流行病学调查研究，区分有毒和无毒菌株；检测细菌内抗药基因；用于分析食品是否会被某些耐药菌株污染，判定食品污染的特性，比如Yasuhara[10]等以啤酒腐败菌中厌氧菌Pectinatus的16S rRNA为靶分子设计寡核苷酸探针，并用荧光标记检测啤酒是否被这种菌污染.

3 生物芯片技术

生物芯片技术是20 世纪90 年代中期以来影响深远的科技进展之一，是融合了微电子学、生物学、物理学、化学和计算机科学等为一体的高度交叉的尖端新技术[11].生物芯片根据反应体系状态的不同，可分为固相芯片和液相芯片，根据检测对象的不同又可分为基因芯片和蛋白芯片.液相芯片较传统的固相芯片相比主要优点在于：检测准确度高，信息质量稳定，检测结果可重复性好，检测用时短以及操作简便.因此液相芯片在生命科学研究的诸多领域，比如病原菌感染的检测方面，有着广阔的应用前景.现在液相芯片技术已广泛应用于基因检测、细胞因子检测、蛋白质分析和药物检测等，极大的推动了临床检测和科学研究的快速发展[12].

基因芯片因其可快速、准确、高效的地显示病原体的遗传信息，已广泛的应用于基因序列的分析、病原微生物感染的快速诊断、病原菌变异及耐药机制的研究，以及基因分型、分子流行病学调查和抗感染药物的研制等[13].基因芯片技术的兴起也给微生物检测带来了新的革命，近年来已有此技术应用于大肠埃希菌、痢疾志贺菌、伤寒沙门菌检测的报道[14]，应用基因芯片技术还可鉴定分枝杆菌菌种和检测结核分枝杆菌耐药基因[15].随着基因芯片技术的不断完善和发展，以及众多的微生物全基因序列的测定，在将来人们或许可以在一张芯片上检测出几乎所有的病原菌.

综上，生物芯片技术与传统微生物检测方法相比，样品需求量少，检测效率高，因此在微生物检验领域有着广阔的发展和应用前景.

4 其它分子生物技术在微生物检验中的应用

在食品微生物检验中，ATP生物发光法可用于生乳中细菌的快速检测[16]，这种方法具有准确、便利、快速的优点，能够在 5～10 min内检测出牛奶中细菌的数量.

快速检测病原菌的自动分析系统也越来越多，比如Dupont de Nemours公司生产的Ribo PrinterTMDNA指纹图谱自动分析系统，通过该系统得到的核酸图谱与其他贮存的核酸碱基序列进行比较，通过核酸匹配分析可以对微生物进行鉴定.

另外，气相色谱和高效液相色谱的分析也应用到致病微生物的检测中，主要是依据不同病原体的化学组成或所产生的代谢产物各异，利用上述色谱检查可直接分析各种体液中的细菌代谢产物、细胞中的脂肪酸、蛋白、氨基酸、多肽、多糖等，以确定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测，其中以气相色谱应用较多，该法简单、快速[17].

5 分子生物学技术在微生物检验应用中的发展趋势

分子生物学技术在微生物检验应用中的发展趋势主要体现在以下三个方面：一是朝着高度特异性、高度灵敏性和高度自动化的方向发展；二是会进一步与其它学科技术交叉融合，打破各技术之间的局限，从而将检验的范围扩展；三是新的分子生物学技术还将会不断的产生，其在微生物检验中的应用也将越加广泛.

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