脾脏树突状细胞的研究进展

张江兰，吴靖芳，邵素霞

（1.河北北方学院基础医学院组胚教研室，河北 张家口 075000；2.河北医科大学组织学与胚胎学教研室，河北 石家庄 050017）

脾脏是体内最大的单个淋巴器官，约占全身淋巴组织总重的1／4，拥有大量免疫细胞，其中包括Mφ、树突状细胞 （dendritic cell，DC）、淋巴细胞等。DC是机体目前所知的功能最强大的抗原提呈细胞，也是唯一能激活初始型T淋巴细胞的抗原提呈细胞，对机体T细胞介导的细胞免疫反应起至关重要的作用，在机体的免疫应答中处于中心地位，并控制着体内免疫反应的进展过程，因而成为肿瘤免疫反应的中心环节。目前DC已经成为生物治疗领域的研究热点，对DC的研究日趋深入而广泛。现就脾脏DC的研究状况进行简要的回顾与展望。

1 脾内DC的来源和分类

DC最初是Steinman和Cohn等1973年从小鼠脾脏中分离发现的，因其形状具有树突状或伪足样突起而命名。目前已经陆续被人们一致认为，凡细胞膜表面高表达MHC－Ⅱ类分子，并具有一些相对特异性表面标志，有DC典型的形态，能移行至淋巴组织或淋巴器官，刺激幼稚型T细胞增殖活化的一类细胞可称之为树突状细胞。DC为数量很少的一个群体，主要来源于髓系和淋巴系干细胞。淋巴来源的DC，主要分布于脾T细胞居住区；而骨髓来源的，主要起源于骨髓中的CD34＋多向性造血干细胞，发育为DC前体细胞 （pDC）后进入外周血中，随血液脾脏中归巢，发育成未成熟DC。

根据部位的不同，脾脏的DC可分为三种［1］，一种为并指状树突状细胞 （interdigitating DC，IDC）位于胸腺依赖区，即白髓内T细胞区，动脉周围淋巴鞘内层。IDC的星状突起插入其他细胞之间，对抗原特异性T细胞具有很强的刺激作用；一种位于B细胞区的称为滤泡DC（follicular dendritic cells，FDC），突起长而细，能在其表面较长期地保留抗原抗体复合物；一种位于边缘区并延伸到红髓内，数量约占脾脏DC总量的75%［2］。根据刺激T细胞增殖能力的不同，按成熟情况分为未成熟DC （immature dendritic cell，imDC）和成熟DC （mature dendritic cell，mDC）。imDC缺乏或低水平表达许多重要的介导黏附和刺激T细胞的辅助分子，其在特异的细胞因子的作用下诱生为mDC，在炎性因子的驱化下，这些成熟的DC向T细胞区域迁移，启动免疫反应。

2 脾脏DC的表面标志

脾脏DC是一群异质性细胞，表达不同表面分子的DC的含量和分布有所不同。大部分脾脏DC为imDC，具有活性的mDC含量较少。脾DC在不同的种属、组织和不同的阶段都有不同的表型。共同点为imDC低水平表达MHC-Ⅱ分子、共刺激分子CD80和CD86，炎性刺激可使imDC获得成熟，并高表达MHC-Ⅱ、CD80和CD86分子［3］。在人脾脏DC除了表达这些分子外，还表达CD11c、CD83、CD205、CD209和HLA-DR。其中CD11c、CD205和CD209是目前较特异的人脾脏DC标志物，imDC受到抗原刺激后，能很快在细胞膜表面表达HLA-DR［4－5］。小鼠脾脏DCs还表达CD11c、CD40和CD205，一旦DCs被激活，所有分子的表达水平将增高，并DC很快表达CD86分子，其中CD205是小鼠DC特异性标志物。大鼠脾脏CD4＋和CD4－DC表达除表达CD80、CD86和MHC－Ⅱ分子外，还表达OX62，OX62是识别大鼠细胞膜表面的整合素αE2亚单位，其细胞质可以合成一种为S-100的胞浆蛋白。近年来，陆续有人报道用检测大鼠S-100蛋白来鉴别DC和Mφ，以及检测大鼠脾脏中DC的形态学特征和分布情况，并提出S-100蛋白是郎格罕氏细胞、面纱细胞和交错突细胞等细胞系的一个标志［6－9］。

3 分离与培养

在脾脏中单个的核细胞在总体细胞中所占的比例是比较少的，对于脾脏来源DC的分离和培养受到很多因素的影响，比如操作方法、培养时间、温度、细胞因子用量、收集方式等，可采用免疫磁珠分离法并利用OX62单克隆抗体纯化脾脏来源的DC，但是这种方法价格比较贵，不太适合大规模的培养和研究［10］。岳嘉宁等［11］对上述方法进行改良，在制备大鼠脾细胞悬液的过程中，不使用研磨的方法对组织块进行处理，而采用胶原酶消化法，200目的滤膜过滤后，可以获得的脾脏单细胞悬液量最多。随后采用裂解红细胞液去除细胞悬液当中的大部分红细胞。在密度梯度离心时，加入少量的FBS，可以对单个核细胞起到一定的保护作用。实验中使用EDTA来防止细胞的粘连。最后，每个脾脏获得的细胞数均在108之上，使对脾脏来源的单个核细胞的提取达到了最大限度。

许化溪等［12］利用改良Steinman法提取小鼠脾脏DCs，无菌取脾脏用无血清RPMI1640洗两次，于垫有200目无菌铜网的平皿中研碎，吸取铜网下细胞悬液离心，沉淀物再悬浮于无血清RPMl1640中，加至p＝1.080的Ficon一泛影葡胺细胞分层液上，离心后吸取低密度细胞层经洗涤后用含5%FCS的RPMI1640制成悬液，并置细胞培养瓶中孵育，经IgG包被的培养板亲和粘附法除去FerR十细胞，DCs纯度达80%以上。从脾脏分离出来的，贴壁生长的单核细胞可以通过诱导分化为DC。Yao等［13］将小鼠脾脏消化培养获得了大于90%纯度和95%生存能力的DC。近年来［10－13］的研究显示，通过体外诱导和培养获得的DC与从体内纯化的成熟DC的APC功能是一样的，这样就为更深一步的研究DC及其在临床上的应用奠定了理论基础。

4 DC的免疫功能

4.1 诱导免疫应答

DC作为在机体中起主导作用的抗原提呈细胞，在机体各免疫器官中都广泛存在，是机体免疫反应开启的始动细胞，也是机体抗原提呈细胞中最有效的成分，在这过程中起着关键的作用［14－15］。DC在机体免疫系统中充当着岗哨的作用，不停在它外围的环境中寻找抗原。在机体的内部，对于从未接触过抗原刺激的T细胞频率约为10－4～10－8，数量是比较少的，都是初始型T细胞，不具有任何杀伤和增殖能力，也不能对其靶细胞产生有效的杀伤作用，只有靶细胞经过APCs的加工处理和抗原提呈后，才能使T细胞被激活，并进行增殖，产生有效的免疫反应，但是大多数DC在呈递抗原后就会消失［16］。比如，心脏、肾脏间质中的DC在局部获取抗原后通过血液到脾脏；肝脏内的DC通过血液获取抗原后通过血液循环到脾脏［17］，激发抗原特异性的免疫反应。DC移行到脾脏T细胞区定居下来，选择出能将抗原特异性提呈的少量T细胞进行克隆并激活它们，产生Th1介导的免疫反应，或通过激活B细胞产生体液免疫，清除具有抗原性的物质。但Pulendran［18］研究发现，除产生Th1型应答外，如果脾脏有Th2佐剂到达时，就会通过不同的TLRs活化脾脏中所有的DC亚群，结果是产生了Th2免疫应答，并且能抑制CD8α＋DC，使其诱导Th1活化的潜能降低。

4.2 诱导免疫耐受

现研究表明，DCs具有双重性，除可诱导免疫应答，也具有免疫抑制作用。未成熟DC虽然具有强大的内吞作用，但其抗原呈递功能低下，能分泌多种细胞因子参与免疫耐受的形成。在机体没有感染和没有任何组织损伤的正常情况下，存在于周围组织的imDC在不停地摄取自身抗原及环境中的蛋白质，诱导机体外周免疫耐受，其作用机制主要有：①诱导抗原特异性T细胞无能，正常状态下存在于机体周围组织的imDCs不停的吞噬各种物质，如自体的各种凋亡细胞，在机体中若缺乏Toll样受体 （TLR）活化等DCs成熟信号时，DCs表达的主要组织相容性复合体 （MHC）分子和共刺激分子的量是很少的，会引起在周围循环中相应的T细胞失能；②诱导T细胞凋亡，有报道［19］，Suss等在1996年发现脾中的CD8α－DCs是CD4＋T细胞大量增殖的诱导物，而CD8α＋DCs诱导的部分反应与T细胞凋亡相关，这种凋亡是通过T细胞表面的Fas和DCs中的FasL相互作用实现的，同年，又发现CD8＋DCs通过限制IL-2的表达来调节初始型CD8＋T细胞的反应；③诱导调节性T细胞形成，imDC可以通过诱导具有抗原特异性的CD4＋或CD8＋调节性T细胞 （T-reg）的产生，以抑制T细胞的增殖活化和Th1型细胞因子的分泌活动［20］，从而使机体在正常的状态下对自身的抗原和一些无害的外源性抗原形成免疫耐受。Yamazaki等通过实验研究［21］发现，CD8＋和CD205＋脾脏DC能特异性的诱导Foxp3＋调节性T细胞的产生。陈天宇等［22］证明在应用抗大鼠DC单克隆抗体 （WZD）降低大鼠移植脾的免疫原性。在移植免疫学中供者不成熟DC倾向于引起免疫耐受，成熟DC倾向于引起免疫排斥的观点已被大量实验证实，DC的不均一性对移植免疫中排斥或耐受的调控具有相当重要的作用［23］。有研究学者发现如果小鼠胸腺去除DC后，在体外进行胸腺重建和培养过程中，加入胸腺或脾脏来源的DC均可导致T细胞发生免疫耐受，从而证明DC可诱导产生获得性的特异性免疫耐受［24］。近来研究表明，脾脏DC表达的CD200R与体内广泛表达的CD200结合后可使DC分泌吲哚胺-2，3-双加氧酶 （IDO），能够诱导Tr活化而产生免疫耐受［25］。

5 DC与疾病关系

5.1 严重急性呼吸综合征 （SARS）

战军等研究发现［26］SARS死亡患者脾动脉周围淋巴鞘高度萎缩，只留痕迹或完全消失；边缘区变薄或完全消失；S-100是imDC表达的一种胞浆蛋白，SARS死亡患者脾内白髓中S-100＋DC数较正常平均减少80.49%，有的甚至完全消失，可见SARS患者免疫系统的启动机制遭到严重破坏；CD83是mDC的表面标志之一［27］，而未检测到CD83＋mDC则提示SARS-CoV的入侵未能有效的刺激DC成熟。SARS患者免疫系统中抗原呈递系统遭到严重破坏，SARS病毒不能引发DC成熟。

5.2 多器官功能障碍综合征 （MODS）

在MODS早期［28］，脾DC大量增加并从脾脏白髓边缘区向T细胞区迁移，从而与T细胞形成大面积的密切接触，可以引发过度免疫反应；MODS终末期［29－30］外周免疫器官脾及其DC严重损伤和功能耗竭，不同诱因所致MODS病例的病变基本一致。在MODS组的脾脏中发现S-100和CD1a阳性的DC数量是明显高于正常对照组的，可见在机体遭受损伤和打击后，启动了机体的细胞免疫反应。DC数量增加，但其形态多发生退变、溶解、萎缩或凋亡变性，在它们的外周常常伴有较多的凋亡淋巴细胞和凋亡小体存在，DC的功能发生减退或耗竭。在MODS的终末期，S-100、CD1a标记以及电镜所见到的DC数量增加很多，但大多数已经不具备活性，呈免疫耐受的状态，甚至会起到负向免疫调节的作用。

6 临床应用

近年来研究发现，肿瘤细胞与DC融合、基因转染和肿瘤抗原致敏等已经成为肿瘤免疫治疗中的有效途径［31－32］。

6.1 融合细胞致敏DC疫苗

采用肿瘤细胞与DC相融合的办法，肿瘤-DC融合细胞不但能提供DC的特异性抗原呈递的功能，还能持续提供内源性肿瘤抗原以进入MHC－Ⅰ呈递途径。比如将脾来源DC与NS1细胞融合瘤苗免疫荷瘤小鼠后，可以激发其体内存在的抗NS1肿瘤效应。赵明耀等［33］用融合细胞瘤苗免疫治疗荷瘤小鼠后，其瘤体消失，且在观察期60d内未见肿瘤转移和复发。

6.2 细胞因子基因修饰DC疫苗

细胞因子在DC的发育成熟，和DC对T细胞特异性抗原提呈的过程中发挥着重要的作用。如果将IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12、TNF-α、INF-γ、G-CSF、GM-CSF等细胞因子基因转入不同的肿瘤细胞，并以此对动物进行免疫，发现机体可以产生明显的抗肿瘤免疫应答。Cao等［34］研究发现若用GM-CSF修饰小鼠脾脏DC，并且与小鼠的黑色素瘤细胞进行杂交后获得的DC疫苗，可以诱发产生针对黑色素瘤的特异性CTL，使小鼠在受到黑色素瘤的攻击过程发挥保护作用，其效果明显要比用DC与黑色素瘤细胞杂交的疫苗好。Ogawa等［35］通过试验证明IL-2基因转染脾脏获得的DC和肿瘤细胞制备融合细胞能够诱导出抗肺转移的疗效。

7 小 结

近年来，人们已经对脾脏DC的生物学特性及免疫功能有了一定的了解，并且在部分疾病中应用于临床取得了一定的成果。脾脏DC作为机体最重要的专职抗原递呈免疫细胞，在以T细胞识别肿瘤抗原为核心的肿瘤生物治疗研究中展现了良好的应用前景。DC疫苗是肿瘤治疗的第四模式［36］，是当今癌症治疗方案的不可估量的补充，基因修饰的DC疫苗将会是一种很有实用前景的抗肿瘤方案［37］。我们相信随着免疫学、分子生物学、基因工程技术的发展，人们将对脾脏DC认识的不断深入，以DC为靶点的治疗将为与免疫相关的多种疾病的治疗提供新的途径。

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