体外蛋白质复性方法及小分子添加剂在复性过程中的作用

余秀娟，赵丽艳，张晓光

（1.河北北方学院药学系，河北 张家口 075000；2.中国特种设备检测研究院，北京 100013）

1 引 言

蛋白质是维持生命体正常进行的必不可少的物质，也是生命遗传的第二代密码。蛋白质的复性或折叠问题是生命科学研究中的核心问题之一，蛋白质从它的变性状态转变到它特定的生物学天然构象称为蛋白质复性，这个过程并不复杂。但是，一直以来将变性蛋白质恢复其天然的活性构象却是一项很艰难的工作。

到目前为止，已发展了各种体外辅助蛋白复性方法。在众多体外辅助蛋白质复性的方法中，蛋白折叠液相色谱 （protein folding liquid chromatography，PFLC）法获得了长足的发展。与通常的液相色谱技术不同，PFLC除了能在色谱柱上将目标蛋白与其它组分分开，还能在色谱柱上进行变性蛋白折叠，并且易于放大、耗时较少、容易实现自动化。尤其是蛋白折叠疏水色谱法具有分离条件温和、蛋白质的活性回收率高、色谱柱较便宜以及可用于制备规模的优点，是一种较为理想和具有发展潜力的包涵体蛋白的复性及同时纯化色谱方法。

研究表明，在生物体细胞内辅助蛋白质顺利完成折叠的添加剂有二硫键异构酶、分子伴侣等。受生物体内辅助蛋白质指导新生多肽链进行正确折叠的启发，多种辅助因子如聚乙二醇 （PEG）、精氨酸、组氨酸等也因其作用类似于 “分子伴侣”而成为体外辅助蛋白质复性的小分子添加剂，还有低浓度的变性剂、氧化还原试剂对 （GSH／GSSG）等添加剂均具有促进蛋白质复性的作用［1，2］。但是，仍然有很多蛋白质折叠过程中无法解决的障碍存在，如蛋白质分子间因疏水作用而引起的聚集、半胱氨酸错误配对而形成二硫键连接的问题。尤其是由大肠杆菌 （E.coli）表达的包涵体蛋白质，仍然需要研究和发展不同的复性机制来克服或减少这些障碍［3］。因此，可以通过先进的实验手段捕捉变性蛋白质向其活性结构折叠过程的差异性变化规律，来获得发生在蛋白质复性过程中构象变化的更加详细的信息。

2 变性蛋白质的来源

目前，基因工程技术的发展和蛋白质表达系统的多样性已经为利用微生物大规模生产蛋白质药物和功能蛋白质产品开辟了广阔的空间，人们可以自由地根据蛋白质的用途在体外来选择基因表达系统获得重组的目标蛋白。但是，在E.coli中表达的重组蛋白90%以上都形成了难溶性的聚集体，即包涵体［3］。这些聚集体是不具有生物活性和利用价值的，必须将它们恢复生物活性［4］。将其恢复生物活性需进行必要的步骤，即包涵体回收和溶解。

包涵体的回收是蛋白质复性的首要步骤，根据实验作用方法及要求的不同，已有了多种细胞的破碎方法。这些细胞破碎的方法大致可分为两大类：机械法和非机械法。传统的机械法包括了超声、压榨、研磨、匀浆等；通常的非机械法包括了化学法、渗透法、冻融法以及酶溶法等［5］。近年来，也发展了一些新的方法，如冷冻喷射、激光破碎、相向流撞击等。目前，所用的方法都有其各自的优点及适用范围，要准确选择适当的方法必须有理论知识和实践经验作为指导。例如，如果是用作蛋白质的结构及功能的研究，所选择的方法必须不能影响目标蛋白质的复性效果。

超声破碎法［6］是实验室常用的一种细胞破碎法。超声波在少量样品的处理使用中操作简便、破碎液的损失较少，在实验室的使用很常见。酶溶法［7］是一种利用生物酶将细胞的细胞壁及细胞膜进行消化溶解。采用酶溶法来处理实验细胞，要根据细胞的结构以及化学组成来选择合适的酶。采用酶溶法时应注意温度、酶的用量、溶液的酸碱度以及时间等的控制和把握。有些化学试剂可以改变细胞壁和细胞膜的通透性，这些化学试剂可使细胞内的物质有选择地渗透出来，这就是化学渗透法［8］，常用于处理培养的动物细胞。

在大肠杆菌中高水平表达形成的包涵体，由于其不溶性和致密性，大多数通过超声破碎法以及离心处理就能相对容易与细胞的其他成分分离纯化，这是包涵体的一个很重要的特点。粗纯化的包涵体蛋白很稳定，只有在高浓度的变性剂8mol／L脲或6～7mol／L的盐酸胍溶液中才能充分溶解。溶解的包涵体蛋白得到了完全的变性，这时除了其一级结构和共价键保留，其它的疏水键、氢键已经完全破坏了，疏水的侧链已完全暴露。若包涵体蛋白含有较多的二硫键，可能会产生肽链间和肽链内的错误搭配。通常在这样的情况下，采用在复性前向缓冲液中添加一定浓度的还原剂 （如β－巯基乙醇、二硫苏糖醇等）来打开这些二硫键，复性过程中加入氧化剂 （如谷胱甘肽）促进二硫键的正确形成［9］。根据不同的蛋白质选择合适的增溶剂是非常重要的，是能否获得高折叠产率蛋白质的关键步骤［10］。

3 体外辅助蛋白质复性的方法

蛋白质折叠是重组蛋白质大规模复性的关键步骤［11］。目前，变性蛋白质体外复性的方法主要有传统的辅助复性法，如稀释法、透析法［12］、超滤法［13］以及新发展的液相色谱 （LC）法或称为蛋白质折叠液相色谱法 （PFLC），也有在此基础上模拟体内分子伴侣、折叠酶、人工分子伴侣、反胶束的辅助复性方法。

3.1 体外辅助蛋白质复性的传统方法

稀释法、透析法和超滤法是蛋白质在溶液中直接进行体外蛋白复性的方法。其中稀释法是最简单、使用频率最高的蛋白质复性方法。通过加入复性缓冲液直接的、高倍数的降低变性剂浓度，为蛋白质提供折叠环境。可以说无论是利用模型标准蛋白来研究变性蛋白质的复性，还是对于重组的包涵体蛋白复性的研究，稀释法都是首选的方法。蛋白质折叠是分子内的一级反应过程，而聚集体的生成则为二级以上的反应过程。蛋白质的浓度的降低有利于提高蛋白质复性回收率，而当变性剂的浓度降低到一定程度时，一些抑制剂会失去抑制蛋白聚集的作用，从而导致蛋白重新聚集［14］。所以稀释复性过程中，稀释倍数也是一个非常关键的参数。但是，在稀释法复性过程中，稀释体积大比例的增加为复性蛋白的后处理带来了困难，通常导致回收率较低。

透析法［15］是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离效果的方法。在蛋白质复性中可借助于蛋白质分离的同时，在去除溶液中分子量小的杂质而达到复性的目的。此法缺点是循环费时，且在膜内目标蛋白仍会形成沉淀而聚集，常被用于其它复性方法之后小分子物质去除。

超滤法是一种膜滤法，它以多孔的薄膜作为介质，利用薄膜两侧的压力差来分离溶液中不同分子量的物质。

稀释法和透析法是常用于实验室小量蛋白复性研究的两种方法。

3.2 体外辅助蛋白质复性液相色谱法

综上所述，且有实验证实，利用传统的稀释法和透析法进行一些聚集态包涵体蛋白的复性是非常困难的［11］。近年来，PFLC在蛋白复性的多种方法中得到了长足的发展，已经被作为蛋白质复性与同时纯化的一种重要手段［16］。目前，用于蛋白质复性的PFLC法主要有疏水相互作用色谱 （HIC）、离子交换色谱（IEC）、亲合色谱 （AFC）以及尺寸排阻色谱 （SEC）法［17］。

3.2.1 HIC

HIC是利用样品各组分与填料之间的不同疏水作用来进行分离的一种方法，是蛋白质折叠的一种重要方法［18］。HIC能吸附变性蛋白质的疏水位点，其中包括HIC柱为变性蛋白质的吸附和洗脱提供适合的折叠环境及分离纯化折叠缓冲区中的混合物。使用HIC分离复性蛋白质的优势在于不仅可以获得高的折叠产量而且可以得到高纯度的目标产物。采用HIC复性重组人干扰素的折叠产量是普通稀释法的两倍［19］。2004年，Geng XD等［20］将HIC用于rhIFN－γ复性与同时纯化，发展了工业规模的HIC复性与纯化，方法是基于化学平衡和分子间的相互作用的原理。当溶解于7.0mol／L盐酸胍的rhIFN－γ直接以100mL／min的流速在HIC介质的色谱柱洗脱后，目标蛋白的纯度可达95.0%，比活为8.0×107IU／mg。实验也证实了采用HIC复性rhIFN－γ的折叠产量是普通稀释方法的62倍。

利用HIC复性蛋白质来增加复性效率比其它方法更加有效，这是因为疏水介质和未折叠的或不完全折叠的蛋白聚集体的疏水作用阻止了分子间的相互作用［19］。由于蛋白质的折叠过程主要是疏水残基之间的相互作用，蛋白质折叠的过程取决于分子间的疏水作用力，所以实验中HIC介质的选择是非常重要的［21，22］。Li JJ等［23，24］的报道中提到，利用疏水作用力强的配基会导致蛋白质的错误折叠。但HIC法的优点是可以通过调节缓冲液的成份及比例，改变蛋白质与基质间的疏水作用力。当在折叠缓冲液中加入丙三醇和脲时，缓和了疏水作用力同时可以促进蛋白质复性和提高蛋白质的折叠效率［20］。实验结果显示，当折叠缓冲液中存在50% （v／v）丙三醇和脲时，用HIC柱洗脱未折叠的Lys，可获得的蛋白质复性质量回收率为85.0%，活性产量为86.3%。当折叠缓冲液中没有添加丙三醇时，获得的活性产量仅为50.9%。

一些研究也表明了，影响HIC柱折叠病毒蛋白质的因素还包括流动相的盐类、pH值和梯度洗脱的模式。Wang CZ等［25］研究了重组朊蛋白的HIC复性与纯化，通过优化固定相、流动相 （pH值、盐类）以及梯度洗脱模式的影响因素，可使蛋白质复性质量回收率达到87.0%，纯度为96.0%。Wang F等［26］尝试用HIC法复性干扰素，通过减小盐酸胍的浓度增加聚乙二醇的浓度，用台阶式梯度洗脱法成功地完成了干扰素柱上折叠，并与稀释法比较，此法在聚乙二醇的存在情况下使蛋白质的复性质量回收率增加了30.0%，活性回收率是稀释法的2.6倍。所以，流动相的组成、洗脱模式以及流速是HIC法蛋白质复性重要的影响因素，在实验中要把握好这些条件的选择。因此，HIC具有分离条件温和、分辨率高、负载量大、复性蛋白质的活性回收率及纯度高的优点，是蛋白质复性最常用的方法之一。近年来，随着HIC柱固定相介质种类研发，可采用的HIC复性与纯化的蛋白质种类增多，使HIC法得到了迅速的发展。

3.2.2 IEC

IEC是利用离子交换剂与溶液中的离子发生相互交换反应进行分离的方法。离子交换剂是一种固体状的多孔颗粒，可在水溶液中浸湿和溶胀。这些多孔颗粒表面有许多可电离的基团，当其在水中电离时，其中有一种离子可在水中自由移动，而另外有一种却在固定相上不能自由移动。这些可自由移动的离子能被同类的其它离子置换，即为离子交换。IEC以离子交换剂为固定相，以含特定离子的溶液作流动相，利用离子交换剂上可交换的离子与溶液中的离子发生交换作用。

IEC复性法是利用被分离的蛋白质与色谱介质的结合，使变性的被分离蛋白与色谱介质结合而减少互相凝集，随着流动相成分的改变，结合于色谱介质的变性蛋白质被洗脱，在发生复性的同时因色谱的作用也被同时纯化［27］。在研究采用IEC进行蛋白质复性时，很多实验结果显示，色谱条件流速、进样量、流动相中的pH值、添加剂脲的浓度以及谷胱甘肽的氧化率都是影响复性效率的主要因素，其合适条件的选择均可以促进蛋白质的柱上折叠。Wang CZ等［28］报道了在最优化条件下复性与同时纯化重组人粒细胞集落刺激因子 （rhG-CSF），可使rhG-CSF复性产物质量回收率达到49.0%，纯度为96.0%，比活为3.0×108IU／mg。因此，用于IEC法复性与同时纯化变性蛋白，其最优化色谱条件和添加合适的添加剂均能提高蛋白质复性的效率。当然，针对不同的变性蛋白质需要进行最优化工艺的研究。Bai Q等［29］报道了用IEC法复性与同时纯化重组人白巨噬细胞集落因子 （rhGM-CSF），通过优化流动相的pH值、脲浓度以及GSH／GSSG的比例，获得目标蛋白的复性产率为58.8%，纯度为96.2%，实验得到的蛋白比活为1.66×107IU／mg，在流动相中添加合适配比的GSH／GSSG可促进二硫键的形成，增加目标蛋白质的产量。还有一些其它的条件如变性蛋白的浓度、流动相中盐的离子强度、温度等，这些都是IEC柱上复性的重要因素。还有一个重要的因素是缓冲液的离子强度，如半胱氨酸的基团可能与蛋白质之间的静电作用有关［30］。如果流动相中的pH值远离蛋白质的等电点，可以减少错误折叠和聚集形式蛋白的生成几率［31，32］。IEC介质在的蛋白质折叠过程中也起到了关键性的作用，合理选择阳离子还是阴离子介质可对蛋白复性效率的提高起到积极的辅助作用。近年来，为了提高IEC对蛋白质的复性效率，发展了许多增加复性产量和减少成本的IEC的有效复性方法。Jin T等［33］报道了用IEC法进行脲浓度梯度变化折叠重组人干扰素-γ并获得了成功，复性的产率达到54%，比活为7.5×105IU／mg。同样的方法用于牛血清蛋白 （BSA）也取得了成功，折叠产率可到55%。因此，IEC法是用于蛋白质复性，尤其是多种包涵体蛋白质柱上复性有力的工具。

3.2.3 SEC

SEC法，又称分子筛色谱法。它是一种溶质与固定相或流动相之间均无相互作用的一种蛋白分离方法。其原理主要是根据分子的尺寸大小差异分离的，即其固定相 （多孔凝胶）能有效地进行分子量大小不同的蛋白质的分离。

基于蛋白分子的大小和其分子量分布范围大的条件，对一个天然态完整的球型蛋白，通过多孔填料的SEC柱时，孔大小与分离的蛋白大小相似是至关重要的，SEC可用于未知成份的样品的不同分子量大小的 “组分离”。通常的情况下，由于理想的SEC法中分子量大的蛋白质在某种意义上与SEC固定相之间不存在任何相互作用即可达到分离的目的。因此，SEC只作为一种蛋白的粗分离方法。

同样，在采用SEC复性蛋白时，除了选择合适的色谱固定相和流动相外，流动相的流速和进样量的优化也是非常重要的。Wang CZ等［34］研究表明，增加流动相的流速可以减少聚集，而低的流速使蛋白质有较长的折叠时间。合适的进样量可以提高高浓度蛋白质的折叠效率，已有研究报道了色谱的进样量一般为柱体积的2%～4%，一般不超过5%［35］。此外，还有通过优化流动相的pH值、脲浓度、氧化还原环境等来提高蛋白质的折叠产率。Ejima等［36］在流动相中添加了0.2mol／L～0.75mol／L精氨酸来复性鼠单克隆抗体和重组白介素-6、碱性成纤维细胞生长因子和干扰素－γ。结果发现，流动相中精氨酸的存在能减小固定相与蛋白质间的选择性相互作用，提高了蛋白质复性的质量回收率。

3.2.4 AFC

AFC法分离蛋白质的原理是基于蛋白质与AFC固定相之间的高选择性和专一性的作用。很多生物大分子具有与其结构对应的专一分子可逆结合的特性，如：抗原和抗体、蛋白酶与辅酶、核糖核酸与其互补的脱氧核糖核酸等体系、激素与其受体，都具有这种特性，生物大分子间的这种专一的结合能力称为亲和力。Lichty等［37］的综述中列出了多种蛋白质与AFC固定相之间的选择性和特异性的作用。

Katoh等［38］采用AFC复性碳酸酐酶。将与碳酸酐酶相应的抗体键合装柱，使变性的碳酸酐酶经过色谱柱，将蛋白质进行折叠复性获得较高的复性产率。用AFC法复性与纯化重组蛋白一步就可以达到较高的纯度［39］，从而减少了变性蛋白质复性过程中的损失。根据配基不同，常用的有固定化金属亲和色谱（IMAC）和免疫亲和色谱法。IMAC金属离子作为一种螯合剂键合在色谱固定相上，常常被用于含二硫键的重组蛋白质的复性与纯化的研究，特别是含组氨酸 （His）的重组蛋白。通过在重组蛋白质复性中引进His标记后，可进一步利用对His的选择性进行复性与纯化。

大量合成带有特异性纯化标签的融合蛋白被广泛使用，使得蛋白折叠与纯化变得更为容易。Li M等［39］采用IMAC一步复性在大肠杆菌中表达的包含有六个组氨酸标签的重组人IFN-λ1，其含有Ni2＋-次氮基三乙酸琼脂糖，获得了纯度达95.0%的高产率。Shi ZX等［40］比较不同方法复性与纯化带有谷胱甘肽转移酶标签的重组人Delta-like1蛋白也发现了，利用一步GSTrap HP亲合色谱柱复性目标蛋白可获得的最高纯度达95.0%。

相对于IMAC，免疫亲和色谱具有更高的选择性，利用了一种可专一性结合靶体的蛋白质，典型的抗体与相应的抗原就是例子。以蛋白A为基础的AFC是一种常用的方法，蛋白A-AFC的特殊用途是以高特异性方法捕获抗体。然而，AFC柱制备成本高，不易规模化。近年来，在AFC柱的成本降低方面取得了大的进展，Yasuda等［41］采用刀豆蛋白A （Con A）-琼脂糖和固定化硫代α－半乳糖苷琼脂糖 （thio-Gal）AFC柱快速有效的纯化重组人α-Gal A，获得的质量回收率为62.0%。由于AFC法具有的高选择性，现也已经发展为一种非常实用的蛋白质复性与纯化工具。

4 小分子添加剂在蛋白体外复性中的作用

如上所述，各类的体外辅助蛋白质复性技术都能不同程度地促使蛋白质复性，但是蛋白质复性效率的提高仍然是个难点。当蛋白质在体外复性时，蛋白质复性效率实际上取决于正确折叠过程与聚集过程之间的竞争，即天然活性蛋白质形成与聚集体的形成之间的竞争［42］。聚集体的形成常常被认为是有一个 “熔球态”的中间态，它的形成是由于疏水基团的暴露，使其自身容易发生聚集的结果［43］。为此发展一些不同添加剂复性的方法，可以通过添加一些小分子促进剂来辅助蛋白质折叠，抑制聚集体的形成。其主要以促进蛋白质折叠过程中正确的天然结构的稳定性、促进折叠中间产物的溶解性以及减少错误折叠复性蛋白质的稳定性为目的。小分子添加剂有以下6类：①表面活性剂或去垢剂：早期用3-（3-胆胺丙基）二甲氨基-1-丙磺酸 （CHAPS）、Trition X-100、磷脂、脱氧胆酸钠等一类小分子作为添加剂。实验的结果显示，这类小分子试剂在一定程度上可以促进蛋白质的折叠，但是，其中有一个需要克服的困难是其与蛋白结合后很难除去；②助溶剂：聚乙二醇系列 （PEG 6 000～20 000）。添加此类小分子，可以与蛋白折叠的中间产物特异结合，形成非聚集形式的化合物，同时这些化合物的存在大大减少了蛋白分子之间的结合机会，从而更进一步地减少蛋白聚集形式的形成。③氧化还原剂：若目标蛋白质结构中含有二硫键，则在蛋白折叠时需加入适量的氧化还原剂，从而促进蛋白质中二硫键的正确对接。常用的氧化还原剂有GSH／GSSG、DTT以及β－巯基乙醇等［1］。④蛋白质促进剂：模拟体内折叠酶的一类可以协助细胞内新生的肽链折叠成具有活性的蛋白质的酶，可以催化与蛋白质折叠必需的直接相关的共价反应。如肽酰脯氨酰顺反异构酶和蛋白质二硫键异构酶。分子伴侣的作用是可以与蛋白质结合且可以稳定蛋白质的构象，并且利于新生的多肽链的折叠［44］。⑤人工伴侣：除了人工合成的分子伴侣外，还有一类类似人工伴侣的小分子环糊精、脂质体等可作为添加剂促进变性蛋白正确的折叠。⑥其它添加剂：一定浓度的L－精氨酸可以破坏错误折叠的蛋白以及错误对接的二硫键的稳定性，而有利于蛋白的正确折叠。甘油的添加也能提高复性液的黏度，降低分子碰撞和错误的蛋白结合的几率，从而提高折叠效率。此外，还有一些小分子的添加剂如脲、盐酸胍以及一些金属离子的添加 （Mg2＋、Cu2＋）等，在一定程度上都到可以抑制蛋白的聚集，起到提蛋白折叠产率的作用。

目前，稀释添加法和色谱柱添加剂的使用均能很好地促进蛋白质复性，提高蛋白复性的效率。其中盐酸胍、脲、L-精氨酸以及氧化还原剂是常用于实验室中蛋白折叠的辅助剂［45］，然而它们的作用却是 “双刃刀”，低浓度时可以抑制蛋白聚集促进蛋白折叠，高浓度却能使蛋白变性。因此，合理地在溶液复性和柱上复性过程中添加小分子试剂是至关重要的。

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