设计利用现代科学仪器 紧跟科学前沿的细胞生物学实验

薛雅蓉，庄 重，刘智慧

（南京大学 生命科学学院，南京 210093）

2006年，国务院《国家中长期科学和技术发展规划纲要（2006—2020年）》中提出，到2020年使我国进入创新型国家行列。胡锦涛同志在2012年的全国科技创新大会上又重述了这一目标。这都说明在我国的未来发展战略中构建创新型国家的目标是势在必行、势在必得。

创新型国家建设需要创新型人才，而大学又是培养创新性人才的重要基地。在大学教育中，实践／实验教学是培养创新型人才的重要环节。很难想象陈旧的实验教学内容能够培养出创新型人才。因此，需要广大的实验教师和科技工作者设计出紧跟科学前沿发展的新实验教学项目，为创新人才培养奠定基础。

科学仪器的发展能够推动科学技术的发展，主要表现在拓宽了科学研究的领域，开拓了新的科学前沿［1］。科学仪器也是高校开展创新实验必不可少的硬件条件，具有非常重要的作用。各个高校对这一点都已有明确的认识并在不断改善实验条件，使硬件条件不再成为限制开展创新型实验的羁绊。但仅有科学仪器是不够的，教师必需关注学科的最新进展，利用先进的科学仪器开展创新型实验，将科学仪器真正转变成辅助创新型实验教学的工具。

细胞生物学与我国现代生物产业发展的五大重点领域（生物医药、生物农业、生物能源、生物制造、生物环保）都有交集和关联，该领域涉及的检测技术是整个生物领域的基础和重要组成部分，在高校相关专业学习的大学生是这个领域未来的中坚力量，了解和初步掌握这些前沿检测仪器和手段对他们是十分必要的。这也是我们设计相关实验、并与同行交流的初衷。

1 细胞生物学现代科学仪器及其在细胞生物学研究中的应用

用于细胞生物学研究的科学仪器很多，在这里只介绍目前比较先进的几种科学仪器，而对常规细胞生物学仪器如普通光学显微镜、荧光显微镜及与其他学科交叉应用较多的科学仪器，如电泳仪、电转仪等不做介绍。

1.1 透射电子显微镜

在光学显微镜下无法看清小于0.2μm的细微结构，这些结构称为亚显微结构（submicroscopic structures）或超微结构（ultramicroscopic structures；ultrastructures）。要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。1932年，Ruska利用波长远小于可见光及紫外光的电子波（100kV的电子波的波长为0.003 7nm，而紫外光的波长为400 nm）作为光源，发明了透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM），以透过样品的电子束来成像，使得细胞超微结构（各种细胞器结构）得以清楚观察［2］。

1.2 激光扫描共聚焦显微镜

激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscopy，简称LSCM）是20世纪80年代在荧光显微镜基础上发明的新型生物医学图像仪器。第一台商品化的共聚焦显微镜由美国Biorad（伯乐）公司于1984年推出。它使用紫外或可见光激发荧光探针，并在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置和计算机图像处理系统，从而得到细胞或组织内部微细结构和成分的荧光图像［3－4］。

激光共聚焦显微镜在细胞生物学实验中不可替代的用途包括：

（1）构建细胞三维图像。LSCM在不损伤细胞的前提下，可产生组织细胞的光学切片，对活组织、活细胞不同层次进行观察和测量，所测数据储存于计算机中，经计算机图像处理三维重建软件重组，可得到标本的三维立体结构，揭示亚细胞结构的空间关系。

（2）利用细胞器和细胞成分的荧光探针标记特定细胞器与细胞成分后，可利用激光共聚焦进行细胞器如线粒体、高尔基体，细胞成分如脂质、蛋白、核酸、各种离子含量及存在部位的检测、观察。

（3）粘附细胞的直接分选。

1.3 流式细胞仪

流式细胞仪（flow cytometry，FCM）是20世纪70年代发展起来的一种高科技细胞研究仪器，利用可见光或紫外光对通过仪器的细胞流进行检测分析。主要用途可归结为两个大的方面［5］：

（1）细胞测量与分析：它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，如细胞大小、细胞周期、细胞DNA倍体含量、细胞凋亡情况、抗原表达。

（2）细胞分选：可以根据预选的细胞参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来［6］。

流式细胞仪和激光共聚焦显微镜都可对细胞内荧光标记成分进行分析，但前者却只能测定单细胞的总量，不能分辨其分布位置。后者即可测定其含量，又可观察其分布。

2 几个细胞生物学研究前沿领域

细胞生物学研究的前沿领域包括细胞衰老及抗衰老、肿瘤细胞诱导凋亡 、干细胞及肿瘤细胞的诱导分化 、细胞信号转导 、细胞周期调控、细胞基因沉默等。

2.1 关于细胞衰老的研究

细胞衰老（cellular senescence）是一个应激导致细胞生长停滞的生理过程。细胞衰老及抗衰老研究一直是细胞生物学研究的热点领域之一，研究主要集中在衰老机制、引起细胞衰老的因素以及控制细胞衰老的方法［7］。

美国科学家Denham Harman 1956年提出了衰老的自由基学说，认为生物体衰老过程中的退行性变化是由于细胞正常代谢过程中产生的自由基的有害作用造成的。体外利用过氧化氢诱导培养细胞发生衰老样变化的实验验证了Harman的观点。

无论从哪个角度研究衰老细胞，都需要首先对其进行识别和确定。现在最常用的方法为细胞衰老相关的β－半乳糖苷酶检测［8］。这种β－半乳糖苷酶是一种与细胞代龄（即衰老程度）有关的酶，可在接近中性的条件下作用于其生色底物 X－gal（5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳 糖 苷，5－Bromo－4－Chloro 3－Indoly－（－D－Galactoside，X－gal）生成蓝色不溶物。Dimiri（1995）提出将这种中性β－半乳糖苷酶作为体内外细胞衰老研究的生物学标志，可在反应后用普通光学显微镜观察研究。

有研究者用激光共聚焦显微镜观察比较了正常和衰老的人二倍体成纤维细胞经DAPI染色后的显色差异，结果发现在衰老细胞核中出现呈点状聚集的特征性异染色质结构，被称为衰老相关异染色质灶（senescence－associated heterochromatinfoci，SAHF）［9］，该发现为识别衰老细胞提供了一个新的生物学标志。

2.2 关于肿瘤细胞诱导凋亡的研究

癌症（cancer）是一种对人类健康甚至生命危害极大的疾病，是肿瘤细胞因增殖失控而大量增殖的结果。药物抗癌是治疗癌症的重要途径之一。其中通过干扰肿瘤细胞生长、代谢、增殖等过程并最终诱导肿瘤细胞凋亡是抗癌药物治疗的理想途径。检测细胞凋亡相关指标是了解药物是否通过诱导凋亡机制抗癌、继而寻找诱导凋亡的抗癌药物的前提条件。

凋亡细胞在形态、细胞核、细胞膜、DNA完整性等方面都不同于正常细胞，比较典型的特征如细胞核染色质凝集、边缘化，细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻，DNA从核小体处规律断裂而使电泳呈梯状条带等。普通光学显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪及其他现代科学仪器在检测细胞凋亡的这些现象中都可以发挥其各具特色的作用［10－11］。

2.3 干细胞及肿瘤细胞的诱导分化

细胞分化是指同一来源的细胞逐渐产生各自特有的形态结构、生理功能和生化特征的过程。关于细胞的诱导分化研究更多集中在诱导干细胞向所需细胞类型转化，旨在为临床移植治疗及组织器官功能恢复治疗奠定基础［12－13］。

近年来细胞生物学领域一个倍受关注的课题是肿瘤细胞的诱导分化研究。其原理基于恶性肿瘤细胞与正常细胞的分化程度不同而导致生长及分裂速度不同，恶性肿瘤细胞为去分化细胞，生长及分裂速度远大于正常细胞。诱导肿瘤细胞由去分化状态恢复到分化状态是恶性肿瘤治疗的一个新途径［14－15］。

被诱导分化的肿瘤细胞分裂速度减慢，可通过流式细胞仪准确检测细胞分裂指数得以显示诱导是否成功。

2.4 细胞信号转导

细胞信号转导是指细胞外信号分子作用于细胞受体（膜受体或胞内受体）后引发细胞内的一系列生物化学反应以及蛋白间相互作用，直至细胞生理反应所需基因开始表达、各种生物学效应形成的过程。与信号转导有关的物质包括受体、胞内激酶、胞内信使、转录因子等。调控这些物质可以改变细胞的信号转导过程，引起细胞兴奋或抑制，从而改变细胞功能。检测细胞内第二信使含量变化及信号蛋白磷酸化水平是检测信号转导的主要方法［16］。激光共聚焦显微镜可以观察胞内钙离子浓度的变化，信号蛋白磷酸化水平可通过蛋白电泳后的 Western blot（蛋白质印迹）方法分析。其中Western blot中所用一抗为磷酸化蛋白对应的抗体。

2.5 细胞周期调控

细胞周期（cell cycle）是指由细胞分裂产生新细胞的生长开始到下一次细胞分裂形成子细胞结束为止所经历的过程。

人为调控细胞周期，对于从理论上研究细胞周期的不同特点以及进行植物多倍体诱导［17］、抗肿瘤研究和临床应用都有重要意义［18］。流式细胞仪在分析细胞周期方面非常有用［19］。

2.6 RNA干扰引起的细胞基因沉默

这主要指利用小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）引起细胞特定基因转录后特异性不表达。通过特异性的沉默基因，可实现研究特定基因功能、调节细胞生长分化、封闭不良基因表达等［20－21］。RNA干扰引起的因基因沉默而表达蛋白水平下降通常通过蛋白电泳后的Western blot方法分析，如果是对细胞生长相关基因的沉默则可用流式细胞仪分析细胞周期的方法加以显示。

3 利用现代科学仪器设计紧跟科学前沿的细胞生物学实验

3.1 细胞衰老的诱导与观察

用双氧水诱导培养的293T细胞或其他细胞产生衰老变化，然后用X－gal染色并用普通显微镜观察衰老相关的β－半乳糖苷酶活性的变化；或用DAPI（4’，6－diamidino－2－phenylindole），对正常肿瘤细胞与发生衰老变化的肿瘤细胞进行染色后再用共聚焦显微镜观察染色质着色特征的差异。

3.2 肿瘤细胞的诱导凋亡与检测

用羟基喜树碱等可诱导肿瘤细胞发生凋亡变化的抗肿瘤药物处理S－180腹水瘤细胞、Jurkat细胞，然后进行不同处理后用普通光学显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、电泳仪等检测细胞发生的凋亡变化。

（1）普通光学显微镜观察：制备细胞涂片，用瑞氏染液或吉姆萨（Giemsa）染液染色后在普通光学显微镜下观察细胞形态及染色质的变化，以及是否形成凋亡小体等。

（2）电子显微镜观察：制备细胞电镜标本，进一步观察染色质的凝集及分布以及细胞超微结构的其他变化。

（3）激光共聚焦显微镜观察：用 FITC－AnnexinV／PI对细胞进行双染色，染色后的细胞标本用激光共聚焦显微镜观察正常细胞、凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞、坏死细胞的染色特征；

（4）流式细胞仪测定：用流式细胞仪将凋亡细胞、正常细胞、坏死细胞分开，统计凋亡细胞比率，检测药物诱导凋亡的效率。

（5）用电泳仪：提取细胞DNA，琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞的特征DNA条带，进一步证明细胞发生的凋亡变化。

3.3 骨髓造血干细胞的分离及诱导分化检测

可利用细胞磁分选仪及流式细胞仪分离大鼠骨髓CD34＋造血干细胞，然后用IL－3、IL－6、干细胞因子等细胞因子体外刺激其增殖后再与乳鼠心肌细胞共培养，使CD34＋造血干细胞向心肌细胞分化，发生分化变化的细胞用普通光学显微镜即可观察。

3.4 肿瘤细胞的诱导分化及检测

维甲酸是一种肿瘤细胞诱导分化剂，可以在体内及体外诱导肿瘤细胞由幼稚型向成熟细胞分化。因此，用含有维甲酸的细胞培养液在体外培养HL－60（人早幼粒白血病细胞系）细胞，可使细胞群中的中幼粒和晚幼粒细胞比例增多、细胞增殖活性下降。细胞分类计数可通过细胞涂片、瑞氏染液染色后普通显微镜观察得以实现；细胞增殖活性可用流式细胞仪检测细胞分裂指数显示。

3.5 细胞的激活及信号转导分子检测

钙离子是重要的细胞内第二信使，当胞内游离钙离子浓度升高至一定浓度时，便与钙调蛋白结合，进而影响和调节众多细胞内代谢活动。细胞内钙离子浓度的升高也是淋巴细胞激活和增殖过程中早期呈现的一个重要现象。因此，可用PHA（植物血凝素）或ConA（刀豆蛋白A）激活淋巴细胞，然后用钙离子荧光探针Fluo－3对细胞进行荧光染色后用激光共聚焦显微镜观察激活前后胞内钙离子浓度的变化。

3.6 细胞周期调控及检测

细胞周期蛋白Cyclins对细胞增殖有正调控作用，这种作用尤以cyclin D1为代表。正常情况下，cyclin D1在G1期是恒定的，其过量表达可导致G1缩短，细胞分裂速度加快，导致细胞增殖失控，甚至形成癌变。用携带细胞周期蛋白D1的质粒pRK5－CyclinD1转染培养的293T细胞，然后收集细胞并用PI染色后可用流式细胞仪检测分析细胞周期中G1期，S期和G2／M期各时相的百分比。

3.7 RNA干扰沉默癌基因及肿瘤细胞增殖检测

c－myc是永生性癌基因，在细胞的生长、繁殖、凋亡及分化中具有极重要的地位。合成针对c－myc mRNA的第1545－1565靶位点的siRNA，然后转染Jurkat细胞，72h后收集细胞并用PI染色后可用流式细胞仪检测分析细胞周期中G1期，S期和G2／M期各时相的百分比，借此显示对细胞增殖的抑制作用。

4 结束语

总之，利用现代科学仪器，针对细胞生物学学科发展前沿和热点，开设大学细胞学创新型实验，不仅有助于提升学生对现代科学仪器及其在细胞学中的应用的了解，掌握相关学科的基础知识和实验技能，而且有助于提高学生综合应用现代仪器解决细胞学及其他相关学科的科学问题的能力。这种设计实验的思路也有望为其他学科实验、实践教学环节开展创新型教学提供参考。

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