鸡球虫病免疫预防研究现状

王秋悦，郑梅竹，杨 鹏，任铁燕，倪 静，师清博

(1河北科技师范学院动物科技学院，河北秦皇岛，066600;2长春师范学院;3吉林省珲春市牧业管理局)

鸡球虫病是严重危害养禽业的一种细胞内寄生虫病。几乎可以说，凡养鸡的地方，就有鸡球虫。而集约化养鸡场则更是球虫病爆发的适宜场所。一直以来，鸡球虫病主要依靠药物来进行防治。近年来药物在球虫病控制中的作用越来越受到限制，因而用免疫方法控制鸡球虫病逐渐受到重视，并有望成为主要的技术手段。近年来随着分子生物学和现代生物技术的发展，鸡球虫疫苗以其独特的优势显示出在未来球虫病控制中的诱人前景，并可能成为鸡球虫病防治的主要手段。为了全面控制鸡球虫病，人们对鸡球虫病的保护性免疫机制进行了研究，并在此基础上进行了疫苗的研制。利用球虫疫苗防治鸡球虫病，不仅能彻底解决鸡球虫耐药性的问题，而且对于生产绿色食品、保证人类健康是一必不可少的前提。自从1965年Coccivac疫苗问世及1985年Immucox疫苗研制成功以来，抗鸡球虫病疫苗已经在养禽中得到应用。球虫疫苗的研究经历了活苗、亚单位苗和基因工程苗这几个研究阶段。

1 球虫活苗

早期人们就注意到了鸡体在感染1次球虫后，能够对再次球虫的侵袭产生某种程度的抵抗力，反复感染后能使鸡产生较强的免疫力。为此，研究者设计了先用小剂量的卵囊或致弱的卵囊免疫鸡，并且已经研究出许多实用的疫苗。球虫活苗是目前唯一在实际生产中投入使用的球虫疫苗，主要包括强毒活苗和弱毒活苗［1］。

1.1 强毒苗的研制

鸡球虫免疫预防的研究最早采用强毒虫活苗。强毒苗的虫株是直接从自然界发生球虫病的病鸡体内或粪便中分离出来的，然后采用单卵囊分离法分离并增殖各种艾美耳球虫卵囊，再按一定比例混合配以适当的稳定剂，即组成强毒活苗。到目前为止，商业化野生型虫株活疫苗在集约化鸡场已经使用了近50年，广泛应用于主要禽类生产国(美国、加拿大、巴西、南美的一些国家，欧洲和亚洲的许多国家)，仅Coccivac和Immucox 2001～2004年就销售了25亿份［2］。

1.2 弱毒苗的研制

弱毒活苗是从鸡的粪便中通过饱和盐水漂浮法收集到卵囊后，采用单卵囊扩增法来纯化卵囊，然后通过减弱虫株的致病性得到致弱虫株，这样可以减低对宿主的危害性，并且能够产生足够的免疫力［3］。目前使用的早熟株球虫疫苗有Paracox(含有柔嫩、巨型、堆型艾美耳球虫等7种早熟株)和Livacox(含有堆型和巨型艾美耳球虫的早熟株)，可应用于各种鸡，尤其是种鸡。国内也有许多地方推出了球虫弱毒苗，如北京、河北、上海、广东培育出鸡胚传代、早熟选育鸡球虫混合弱毒苗。这类疫苗为防治鸡球虫病起到了一定的作用。

2 亚单位疫苗

目前处于研究阶段的疫苗还有亚单位疫苗，即利用单抗和DNA重组技术生产出可产生保护作用的球虫蛋白质抗原，并制成疫苗进行免疫控制。Jenkins等［4］用E.acervuLina重组p240/p160子孢子表面抗原和p250免疫原性裂殖子抗原免疫鸡，发现能诱导很好的抗原特异性T淋巴细胞增殖反应，显示出这些重组疫苗能诱导CMI反应。利用配子体抗原进行母源免疫也具有很好的免疫保护效果。Belli SI等［5］采用亲和柱纯化的56，82，250 kU配子体抗原加入弗氏佐剂免疫产蛋鸡，结果发现后代鸡群对E.maxima感染具有明显保护作用，免疫后卵囊排出量下降49.2%，且三者具有共同的抗原表位。现在，已经商品化的配子体抗原疫苗COXABIC在实际生产应用表明，球虫卵囊排出量下降50%～80%，可用于控制生产中的球虫病。Talebi等［6］用来自E.tenella和E.acervuLina抗原序列合成的一个多肽，加弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂免疫鸡，结果显示合成肽疫苗诱导了高水平的抗体和细胞免疫反应，对E.tenella或E.acervuLina能提供部分交叉保护性。

3 重组苗

目前，球虫病研究的焦点仍主要集中在运用杂交瘤单克隆抗体技术、分子克隆技术、免疫标记技术等来鉴定出虫种各阶段的重要抗原，以筛选更多的保护性抗原，制成基因工程多价苗。一些免疫效果较为显著的E.tenella重组疫苗候选抗原如下:

3.1 5401 基因

重组抗原5401是最早报道的鸡球虫抗原表达产物，是Danforth等用抗球虫抗体从cDNA文库中筛选出的一个基因片段，分子量大小为31 kU。Du等［7］将从E.tenella浙江株分离出来的5401基因插入到pET－30a表达载体中，在大肠杆菌中诱导高效表达后，将pET－30a－5401融合蛋白、融合蛋白+佐剂以及融合蛋白+人参皂角免疫雏鸡进行免疫保护性实验，实验结果显示5401融合蛋白免疫雏鸡后能使淋巴细胞的增殖水平和血清抗体水平得到显著增强，具有良好的免疫原性，同时人参皂角和弗氏佐剂均能显著提高机体对5401融合蛋白免疫应答水平。2005年Du等［8］又构建了ZJ111/pcDNA3－5401DNA疫苗，并将其分别以不同剂量口服免疫雏鸡，结果显示淋巴细胞增殖水平明显高于阴性对照组，其中108和109CFU剂量的免疫保护率分别为55%和57.5%。

3.2 λMzp5-7 基因

λMzp5-7是目前研究较多的表面抗原。它既是球虫裂殖子表面抗原，也是子孢子时期的表面抗原。Binger用λMzp5-7基因与痘苗病毒重组构建的重组病毒免疫雏鸡，1周后能在血清中检测到抗λMzp5-7的抗体，且自然感染球虫恢复期获得的血清，能与λMzp5-7重组抗原起免疫反应。2003年秦睿玲等［9］克隆了E.tenella广州株子孢子表面抗原λMzp5-7，全长为936 bp，与Binger等报道的国外株的同源性为98%。然后又构建了λMzp5-7真核表达载体并在细胞内进行成功表达，并将pVAX1－λMzp5-7重组质粒通过滴鼻和肌注方式免疫雏鸡进行了免疫保护效果的研究。结果显示含有λMzp5-7抗原的重组质粒能诱导有效的细胞免疫和体液免疫，而且与对照组相比，卵囊的排出量和排出时间明显缩短，盲肠病变较小，起到了很好的免疫保护效果。

3.3 TA4 抗原

TA4是Brothers等用两个中和性单抗筛选的子孢子抗原，其分子量为25 kU，但在虫体内，其分子量大小为21～28 kU。Brothers等［10］克隆了该基因的全长cDNA，并且发现抗TA4蛋白的单克隆抗体能够抑制子孢子侵入细胞，这说明TA4蛋白可能与虫体侵入宿主细胞有关。潘晓亮等用E.tenella北京株的pET－TA4重组蛋白和表达的活菌免疫雏鸡，发现鸡的相对增重率分别为61.47%和94.15%，相对卵囊排出量为43.95%和78.85%，特别是在感染后5～7 d，粪便中的卵囊排出量明显低于红对照，说明该蛋白具有一定的保护性［11］。吴绍强等［12］将Et1A与TA4抗原以融合方式插入真核表达载体pcDNA3.1中，构建成核酸疫苗pCTE，免疫鸡后攻虫发现，50 μg pCTE并联合干扰素免疫时鸡的增重效果较为明显，而且盲肠病变值变小，ACI在160以上，说明对E.tenella的感染产生了一定的保护力。

3.4 GX3262 基因

GX3262基因是Miller等［13］用多克隆的高免疫鸡血清从E.tenellacDNA文库中筛选出来的，它是第一个报道的折光体蛋白，其序列全长957 bp，其蛋白分子质量为26 kU。GX3262基因在大肠杆菌中以β－半乳糖苷酶融合蛋白的形式表达，其表达产物对E.tenella，E.ruaxirua，E.acervuLina和E.necatrix都有部分保护作用。即GX3262有4个种的交叉性，用天然的或重组GX3262抗原免疫，都能使鸡盲肠病变计分降低 50%［14］。

3.5 CheY－SO7

CheY－SO7的序列涵盖GX3262的序列，是Marck Sharp实验室研究人员用pJC264构建的含SO7基因的表达载体CheY－SO7在大肠杆菌中表达的融合蛋白，用此重组抗原免疫雏鸡后可降低E.tenella，E.maxia和E.acenvuLina中等剂量引起的球虫病变。而且，未经CheY－SO7免疫的鸡群中，经E.tenella攻毒后，85%以上的鸡的盲肠病变记分≥2.0(平均2.90)，而经CheY－SO7免疫的鸡群，85%以上的鸡的病变记分≤2.0(平均1.72)，说明 CheY－SO7 是有部分保护力的［15］。

3.6 微线蛋白MIC

微线是顶复器门原虫一个最小的特殊的分泌细胞器，分泌可溶性蛋白和跨膜蛋白，并将其分泌的蛋白运送至与宿主细胞配体相互作用的虫体表面。这些蛋白在虫体运动和入侵宿主细胞时起重要作用，特别是介导虫体与宿主细胞表面的黏附和传播由寄生虫细胞骨架产生的动力。Tomely FM等［16］从子孢子cDNA中克隆出EtMIC2全序列，序列全长1 209 bp，EtMIC2是球虫微线体上的一种酸性蛋白，该蛋白只在E.tenella孢子化阶段和裂殖生殖阶段虫体的表面表达。在入侵宿主细胞过程中，该蛋白集中在虫体入侵的顶端，侵入宿主细胞后，迅速散布在整个感染细胞的表面。Liillehoj HS［17］用EtMIC2免疫鸡胚，诱导出了较高水平的抗体反应，而且与对照组相比，卵囊排出量降低，身体质量增加。随后他又将EtMIC2与鸡细胞因子(IL－8，IL－16，TGF－β和淋巴细胞趋化因子)联合免疫，结果显示与EtMIC2免疫相比，联合免疫效果更好。

3.7 Rhomboid 蛋白

Rhomboid蛋白是近年来发现参与表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)及表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)信号转导过程的调节器。近年来已在顶器门原虫的Cryptosporidium parvum，Eimeria tenella，Plasmodium berghei，Plasmodium falciparum，Theileria annuLata，Toxoplasma gondii中发现了Rhomboid蛋白(ROMs)［18］，尤其是已发现Rhomboid与顶器门原虫的黏附和侵入宿主细胞有关。

随着人们对弓形虫和疟原虫侵入分子机制的系统研究以及Rhomboid蛋白水解酶的发现及其功能的深刻认识，已经确立了Rhomboid在顶器门原虫侵入宿主细胞过程中水解微线蛋白(MIC)致使虫体进入靶细胞的重要地位。

2004年李建华等［20］在构建E.tenellacDNA表达文库和制备子孢子阶段特异性单抗的基础上，进行了柔嫩艾美耳球虫基因的筛选，获得了E.tenellaF2杂交株rhomboid基因(DQ323509)。该基因开放性阅读框为774 bp，编码257个氨基酸残基。蛋白质同源性比较显示与E.tenella同属顶器门原虫的疟原虫Rhomboid蛋白的同源性最高。随后又将E.tenellaRhomboid蛋白在大肠杆菌进行了原核表达，显示出良好的免疫原性。2005年陈超等研究证明了Rhomboid重组蛋白免疫雏鸡后可对E.tenella卵囊攻击产生一定保护力。2008年杨桂连等［21］又将rhomboid基因克隆至鸡痘病毒载体pUTA2复合启动子下游，构建了真核表达重组质粒pUTA－Rhomboid，用这一重组鸡痘病毒免疫雏鸡后，发现接种鸡外周血CD4+及CD8+T淋巴细胞含量明显高于非免疫对照组，而且重组病毒对鸡的质量增加效果也较为明显，显示了对E.tenella的攻击具有一定的保护效果。2009年王秋悦等构建了E.tenella rhomboid基因穿梭表达载体pMV261－Rho和整合表达载体pMV361－Rho，并在BCG内进行了rhomboid基因的诱导表达和免疫原性分析［22］，动物免疫保护性实验表明，rBCG疫苗对E.tenella卵囊的攻击具有一定的免疫保护作用，可明显改善鸡的质量增加和盲肠病变记分，并诱导产生较高的细胞免疫和体液免疫反应，rhomboid基因与ChIL－2基因联合，构建双价rBCG，其滴鼻免疫组抗球虫指数为184.0;随后又在此基础上构建EGFP标记的rBCG，对Rhomboid蛋白在鸡体内各组织器官中的分布及稳定性和消长规律进行了研究，结果表明，在鸡肝、脾、肺、肾、盲肠各组织器官均检测到rhomboid基因表达，雏鸡免疫14 d后基因表达量达到最高，随后开始下降，至28 d后消失［23］。因此，Rhomboid蛋白既是重要的信息传递分子又是重要的侵入分子，以上这些信息都为Rhomboid作为疫苗候选基因的研究提供理论依据和分子基础。

3.8 蛋白激酶

E.tenella细胞周期依赖性激酶(EtCRK2)与真核生物和其他顶复器原虫细胞周期依赖性激酶(CDKs)非常相似。研究表明CDKs是一类相对保守的酶家族，通过丝氨酸/苏氨酸磷酸化调控底物蛋白的活性，在促进有丝核分裂和减数核分裂周期中是必需的。E.tenellacGMP依赖的蛋白激酶在虫体滑移运动和入侵宿主细胞过程中起重要作用［24］。

E.tenella钙依赖蛋白激酶(calmoduLin－domain protein kinases，EtCDPK)存在于E.tenella子孢子顶器中，能刺激感染球虫鸡的T淋巴细胞增殖，一旦子孢子进入宿主细胞，在宿主细胞膜子孢子侵入处可发现在子孢子滞留的EtCDPK，提示EtCDPK在子孢子入侵宿主细胞时起特殊的作用。

3.9 热应激蛋白

热应激蛋白(HSP)是一大类普遍存在的糖蛋白，位于细胞质内的HSP参与蛋白质的生物合成、折叠和分泌;也有一部HSP定位于线粒体中，粘附到新生成的尚未折叠的前体蛋白上，促进这些蛋白质在基质中的移行和再折叠。球虫在侵入宿主机体过程中，由于所处环境迅速改变，HSP的生成量随之增加，因此HSP的表达被认为有利于虫体适应新的生物环境。Péroval M等［25］研究发现，E.tenella热应激蛋白90(EtHSP90)位于带虫空泡内，在虫体入侵感染过程中表达量增加，使用特异性抗体和格尔德霉素(GA)抑制EtHSP90的功能之后，发现E.tenella入侵宿主细胞和在宿主细胞中的生长发育受阻。在其它顶复器原虫(疟原虫、弓形虫等)中也发现HSP90有类似的功能。

4 DNA疫苗

DNA疫苗又称为核酸疫苗，是利用编码致病菌抗原的基因，加上适当的调控元件(启动子，增强子)直接注射宿主，在宿主体内表达天然蛋白，然后提呈给MHCI和MHCII，因此能被宿主的免疫系统识别。在鸡体内，通常用来源于巨细胞病毒(CMV)的早期启动子或来源于劳斯肉瘤病毒(RSV)的长末端启动子作为DNA疫苗的调控元件。这些载体能使抗原蛋白短暂地有效表达，能长时间诱导较好的保护性免疫力。Songa等［26］将E.acervuLina的3－1E基因与含CMV启动子的表达载体pBK－CMV相连，构建DNA疫苗，分别以不同剂量质粒通过肌肉或皮下注射免疫雏鸡，E.acervuLina攻虫后，发现核酸疫苗免疫组的鸡群卵囊排出量下降50%，而且脾细胞中T细胞亚群和十二指肠的IELs均有明显变化。Kramer等将E.tenellaS07构建的核酸疫苗高剂量(50 ug)免疫雏鸡时，可使球虫感染鸡的卵囊排出量下降75.73%，鸡的质量增速也较明显提高，可达到95.73%。秦睿玲等构建了重组质粒 pVAX1－Mzp5－7质粒，以该质粒免疫雏鸡后，可有效诱导细胞免疫和体液免疫，动物试验表明免疫该质粒后，可有效改善盲肠病变。

5 佐剂苗

CpG序列(CpG motifs)是指一类以非甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸为核心的寡聚脱氧核糖核苷酸(oligodeoxynucleotides，ODN)。CpG DNA可以诱导B细胞分化，直接激活单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞，引起这些细胞分泌Th1样为主的细胞因子，增强天然免疫反应和诱导获得性免疫反应。最近研究发现CpG能激活鸡的巨噬细胞，在体内和体外均具有免疫刺激作用。DallouL等将含有未甲基化的合成CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG－ODNs)与重组蛋白MIC2同时使用，用于鸡胚免疫，进行动物攻毒实验，发现未甲基化的合成CpG寡聚脱氧核苷酸可有效激发重组蛋白MIC2产生更强的抗体水平。

有研究报道人参皂苷对病毒抗原和细菌抗原能增强抗体反应，为了弄清楚人参皂苷是否能作为鸡球虫疫苗的佐剂，Du等用E.tenella重组抗原5401与人参皂苷(每只鸡用量分别为0，0.25，0.50，1.0 mg)免疫3日龄雏鸡，14日龄加强免疫1次，并对随后的E.tenella攻击进行了免疫保护性指标测定。结果含0.5 mg和1.0 mg的人参皂苷的重组抗原能诱导较高的抗体反应和淋巴细胞增殖，卵囊排出量和盲肠病变记分明显降低，说明人参皂苷可能是一个很好的球虫疫苗的候选佐剂。

另外，研究还发现许多细胞因子与重组蛋白一起免疫鸡后，能增强对E.tenella攻击的保护。许多研究都表明，重组蛋白与细胞因子联合免疫的效果比单独免疫重组蛋白的效果好［27］。球虫DNA疫苗与细胞因子联合免疫后，能增强保护性免疫反应。这些都说明细胞因子在球虫感染中有一定作用，是球虫疫苗佐剂的研究目标之一。

目前，虽然人们采用了多种方法来控制鸡球虫病，但是该病的危害仍然非常严重。自从生物技术用于球虫研究以来，已鉴定和克隆了许多鸡球虫基因。到目前为止，用重组抗原免疫鸡，只能诱发对球虫病的部分保护，还不足以有效控制田间球虫病。主要原因是产生这种部分保护性的重组抗原，只是某一种球虫的某一阶段抗原。而鸡球虫生活史复杂，基因组庞大，不同发育阶段的免疫原性和抗原构成都有差异，各阶段都有保护性抗原，不同种类球虫的免疫原性也不同。因此，还需深入研究球虫入侵及免疫逃避机制，进一步筛选保护性抗原，借助免疫学和分子生物学手段，尽可能多地将保护性抗原或者与免疫调节剂联合应用制成多价疫苗，并选用合适的载体系统来递呈抗原，设计同时诱导体液免疫和细胞免疫的有效免疫应答，努力解决抗原表达、免疫途径、免疫佐剂等方面的问题，这是当前乃至今后较长一段时间内球虫疫苗研究的发展方向。

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(责任编辑:石瑞珍)