精子发生的基因调控及其在犬中的研究展望

魏荣兴，熊 前，徐 明

(公安部南昌警犬基地，江西 南昌330100)

精子在睾丸内形成的过程称为精子的发生。精子发生及调控一直是生殖生物学领域的重点研究内容。犬睾丸产生精子的能力受限于遗传，并受垂体促性腺激素和其他因素的控制和影响，这些因素有些间接通过垂体发挥作用，有些直接作用于睾丸组织［1］。基因的表达和调控对精子发生的能力和质量起着至关重要的作用。在人类中，有丝分裂阶段的精原细胞中有405 个基因表达; 精母细胞中无DNA 复制，但许多基因参与这个过程中的基因重组与DNA 修复，其中有442个基因在精母细胞中高度表达，在减数分裂后的精子细胞中有175 个基因表达［2］。

1 犬精子发生过程

精子在睾丸的曲细精管部位生成，其上皮主要由两种细胞构成，即生精细胞和营养(支持) 细胞。生精细胞的依次分裂及分化就是精子发生过程。犬一般在出生时曲细精管还没有管腔，只有性原细胞和未分化细胞，二者在胎儿期就已形成，精子发生始于性原细胞变成精原细胞。由精原细胞发生为精子，必须经过复杂的分裂和形成过程，大致可以分为四个阶段。第一阶段为A 型精原细胞分裂为A1 型和A2 型精原细胞，由A2 型精原细胞分裂而成中间型精原细胞，中间型精原细胞分裂增殖而成的B 型精原细胞，B 型精原细胞经4 次分裂，先后分裂成为16 个初级精母细胞，这时曲细精管开始出现管腔，此阶段需要时间约为14 d; 第二阶段为初级精母细胞进行第一次成熟分裂成为2个次级精母细胞，此阶段需要时间约为21 d;第三阶段是由次级精母细胞再分裂为2 个精细胞，并移近至曲细精管管腔，附着在营养细胞尖端，此阶段需要时间约为0.5 d; 第四阶段为精细胞从营养细胞获得发育所需要的营养物质，经形态改变，细胞核成为精子头的主要部分(含遗传物质DNA) ，高尔基体成为顶体，中心小体则变为精子尾等，并进入精细管腔内，这个过程也称为精子的形成，需要时间约为10.5 d［1］。

2 基因调控

2.1 CAMP 应答元件调节因子

CREM 是CAMP 应答元件结合蛋白(CAMP response eleme binding protein，CREB) 的家族成员，是一种转录激活因子，在各种组织中均有表达，但是在睾丸的浓度比其他任何组织要高100 倍［3］。该家族基因的靶基因调节区域上都含有CREs，如转换蛋白TP1 和TP2、前顶体蛋白(Proacrosin) 和钙精蛋白(Calspermin) 、精蛋白PN1 和PN2编码的基因。这些基因的启动子都有CREs。CREs 是由一个保守的回文系列TGACGTCA构成。CREM 通过识别并结合到靶基因的CRE 上，对靶基因进行转录调节。CREM 的表达主要集中在次级精母细胞和精子细胞中。该基因对精子的成熟是必须的，在精子发生中特别是减数分裂后阶段发挥至关重要的作用。精母细胞完成减数分裂后，许多生殖细胞高度特异性的减数分裂后基因(post meotic gene) 都包含CAMP 应答元件，接受CAMP 的调控［4］。在小鼠中研究发现，敲除了CREM 的小鼠睾丸内，一些非常重要的精子所必须的减数分裂后基因表达缺失，如鱼精蛋白1 和2 及转型蛋白，从而阻断了细胞分化，最终使精细胞发生凋亡，精子发育停留在圆形精子阶段，导致小鼠的不孕不育［5］。同时，CREM 敲除小鼠的睾丸重量比正常小鼠小20% ～25%，精细胞数量比正常的少46%［6］。CREM 含有许多功能结构域，包括与DNA 接合及形成二聚体所必需的C端亮氨酸拉链结构域、富含谷氨酰胺的活性结构域，以及侧翼区域的磷酸受体区域-P盒［7］。CREM 的转录还受到促卵泡激素的调控。Foulkes［8］发现，没有分泌FSH 的仓鼠的睾丸内也没有CREM 转录，但当注射了FSH 后，仓鼠睾丸内CREM 的转录迅速增加。睾丸CREM 的活性依赖与它的激活子蛋白(Activator of CREM in testes，ACT) 。ACT具有活性结构域，能够激活CREM 的表达，并且具有表达组织特异性。Kotaja 等［9］通过小鼠实验发现，在小鼠中敲除ACT 虽然可以完成精子分化过程，产生成熟的精子，但是成熟精子的数量却非常少，并且有许多形态异常和无运动能力的精子，这说明ACT 在精子成型的调控过程中起了重要作用。

在犬中，CREM 位于2 号染色体的1755522-1805805 位置。Uyttersprot N 等［10］对其进行了全测序发现，犬CREM 编码的氨基酸序列跟鼠和人的同源氨基酸序列匹配率分别为94.5%和91.0%。他利用三种不同探针的RNA 酶保护测定法(RPA) 在多种犬组织中分析了多种CREM 转录本的表达情况。发现CREM 转录因子有很强的组织特异表达，它的活化因子和抑制因子在不同组织的比例也相当不同。另外，他通过RT- PCR发现了两个CREM 异构体。然而，目前国际上还鲜有关于CREM 在犬精子发生、发育中的具体功能性研究。

2.2 TSPY 基因

TSPY(testis-specific protein Y-encoded)基因在睾丸中为特异性表达，该基因主要表达于精原细胞阶段，其作用是与精子的分化和增殖有关［11］。也有报道称，TSPY 表达于精母细胞阶段，其参与了精子变态，总之TSPY 缺失可导致精子发生障碍。

在人类中，TSPY1 基因存在大概21 ～35的拷贝数变异。该基因的表达模式和预测功能表明，它可能与精子的发生有关。为了证明这点，Giachini C 等以意大利中部的154个不孕不育患者和130 个正常个体的精子为样本，通过q-PCR 实验得出，TSPY1 与精子发生的数量呈极显著相关(P ＜0.001) ，并且，低于33 拷贝数的样本个体的精子有不正常参数的几率是大于33 拷贝数样本个体的1.5 倍(P ＜0.001) 。这表明TSPY1 与精子发生效率有很强相关，并且低拷贝数的个体更容易不孕不育［12］。但是Nickkholgh B等，以荷兰的100 名低生育能力的个体和100 名正常个体的精子为样本，通过q-PCR和Southern blot 印迹杂交的办法，发现TSPY的拷贝数和精子质量并没有显著的统计学相关［13］。由此可知，TSPY 的拷贝数对精子发生和质量的影响是个非常复杂的问题，需要进一步在功能上进行研究和验证才能下结论。

另外，该基因与生殖细胞的癌变有很强相关性，它位于性腺母细胞瘤的临界区域，它在生殖细胞肿瘤和性腺母细胞瘤中优先表达，并且它与精原细胞瘤和前列腺癌的发生也有很强相关性［13，14］。

在犬中，在12 号染色体的71935792 至71953959 区域发现了TSPY1 的同源基因，但是对于其在犬中的功能上的作用和机制，目前尚未有相关研究。

2.3 SOX 基因

SOX(SRY-related high mobility group-box gene) 基因是一种重要的早期胚胎发育相关基因，是与位于Y 染色体上的SRY 基因(Sex determing region of Y chromosome) 的正下游，该基因负责调控睾丸的形成。

目前发现的该基因家族有20 多个SOX因子中，部分可能跟精子发生有关，比如E组的SOX8、SOX9 和SOX10 在支持细胞中重叠表达。SOX9 在睾丸生精小管上皮细胞呈阶段特异性表达。Good fellow 等发现，SOX9 在雄鼠胚胎的睾丸形成中表达，而在雌鼠的胚胎中不表达［15］; 在后续研究中，Good fellow 等克隆了SOX9 基因，发现它与SRY 氨基酸的高可变区盒(High- mobility group box，HMG BOX) 的同源性大于60%，在睾丸的发育中作为转录因子调控其下游基因的表达。SRY 基因不是直接调节睾丸的发育而是通过SOX9 共同作用才发生作用［16］。

SOX 家族广泛活跃于哺乳动物的多种功能调节中。犬的SOX9 同源基因位于9 号染色体的8275049 至8278172 区域。有报道称，SOX9 基因可能跟犬的性反转现象有关［17］。关于其在精子发生上的作用机制，还在研究过程中。

2.4 HSF 热休克因子

热休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSPs)是生物体(或离体培养的细胞) 在不良环境因素作用下产生的具有高度保守性的应激蛋白，普遍存在于整个生物界，是一类功能性相关蛋白质。当细胞受到升高温度或其他压力时它们的表达就会增长［18］，这种表达的增长是受到转录调控的。

在不存在热休克时，HSF 也调控着精子发生基因的表达［19］。过表达HSF1 转基因小鼠的精子发生阻滞，敲除HSF2 转基因小鼠生育能力低，精子数量比正常小鼠少70%，睾丸重量减少，精原细胞大量死亡。表明HSF2 与生殖细胞的减数分裂和存活有关［20］。

HSF 是犬的一个非常重要的基因，热休克反应和精子发生都是犬的非常重要的性状。这个基因在动物中是个非常保守的基因。在犬中的同源基因位于1 号染色体。目前关于其在犬中的功能上的研究很少，非常值得深入研究。

3 展望

犬的精子发生是个非常复杂而又重要的性状，其中基因对其影响是不可忽视的。上文描述了部分比较重要的基因。目前这些基因在人类、小鼠等其它哺乳动物中研究较为深入和广泛，在犬中，类似的研究却较为匮乏。虽然，由于哺乳动物基因组的相似和同源的特性，犬的精子发生基因的研究可以从其他哺乳动物的研究中得到很好的借鉴和方向，但是相关基因在犬中具体的功能和作用机制必须依靠后续的实验研究和功能验证才能确定。

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