内毒素耐受及相关机制探讨

杨 虎综述，李运璧 审校

(1.泸州医学院，四川 泸州 646000;2.四川省医学科学院·四川省人民医院儿科，四川 成都 610072)

内毒素(endotoxin，ET)又名脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，是革兰阴性(G－)细菌细胞壁上的主要成分。LPS通过激活单核－巨噬细胞系统(mononuclear phagocytic system，MPS)引起白细胞介素－1(IL－1)、肿瘤坏死因子－α(TNF－α)等大量炎性介质的释放，引起全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)、脓毒症(sepsis)、严重脓毒症(severe sepsis)、脓毒性休克(septic shock)的发生，导致机体严重损伤甚至死亡。然而，机体感染G-细菌后的临床表现轻重不一，表明机体对LPS的反应存在差异性，该差异性除了因LPS的感染量和质的不同所引起外，还与机体本身对LPS的耐受性不同有关，即产生了内毒素耐受(endotoxin tolerance)。内毒素耐受是指机体经过小剂量LPS刺激后，对致死剂量LPS的再次刺激呈低反应或无反应的一种状态。经内毒素耐受后的机体，当再次受到内毒素刺激时其细胞因子的释放量、细胞及组织的损伤程度都明显低于非耐受机体。目前认为，内毒素耐受是机体在长期进化过程中形成的一种保护性自身调节机制，是一种适应性应答，避免了机体对LPS刺激的过度反应，是机体防御机制的重要组成部分［1］。内毒素耐受的机制比较复杂，至今尚未完全阐明，目前的研究认为其与介导细胞因子产生的介质表达下调及负性调节细胞因子产生的介质表达上调有关。其中前者以Toll样受体(Toll－like receptor，TLR)通路的改变研究的较多，而后者则少有研究或报道。

1 TLR通路

TLR由基因dToll所编码，而该基因最早发现于人们研究果蝇的胚胎发育中。1996年，Lemaitre等发现dToll发生突变的果蝇极易感染真菌，提示Toll受体具有介导抗真菌感染信号转导的功能［2］。1997年，Medzhitov等在哺乳动物中发现了第一个果蝇Toll样受体的同源物，后被命名为TLR4，其能诱导炎症应答基因的表达，并为LPS诱导信号转导的重要受体。继后，在哺乳动物中Toll受体的同源受体相继被发现，构成Toll样受体家族(TLRs)。迄今为止，在哺乳动物中已发现TLR家族成员共15种，人类特异性表达TLR1－10，而TLR11、12和13只在鼠中表达［3］。近来TLR14和TLR15也相继在小鼠和鸡体内发现［4，5］。TLRs广泛分布于固有免疫系统细胞及部分非免疫细胞表面，如单核巨噬系统、中性粒细胞、T/B淋巴细胞、NK细胞、上皮细胞等。TLRs是一种模式识别受体(Pattern recognition receptor，PRRs)，能够识别微生物进化过程中的一些保守结构即病原体相关分子模式(Pathogen－associted molecular patterns，PAMAs)，介导机体的固有性免疫应答，从而诱导适应性免疫应答的发生［6］。TLRs属于Ⅰ型跨膜受体，分为胞外段、跨膜段及胞内段3区域。胞外段为富含亮氨酸的重复序列(leucine rich repeat，LRR)，可与 CD14 分子结合，参与PAMAs的识别，从而启动信号转导。胞内段与白介素－1受体(IL－1R)的膜内区高度同源，含有一个信号转导结构域，称为TIR结构域(Toll/IL－1R homology domain)。另外，胞内段尚可募集一特殊的蛋白分子—髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)，其为TLR通路上关键的衔接蛋白。LPS激活TLR4主要有两条信号转导通路，而MyD88即为该两条亚通路的分界点。通常根据有无MyD88的参与，可将TLR通路分为:MyD88依赖型信号通路;MyD88非依赖型信号通路［7］。

2 TLR4信号转导通路与内毒素耐受

在TLRs众多家族成员中，TLR4最被人们所熟知，其是唯一可经MyD88依赖型和MyD88非依赖型两条信号通路转导信号的TLRs成员［8］，也是LPS所介导的TLR受体通路的主要成员。而大量研究表明，LPS耐受与TLR4信号转导通路间有着密切的关联。

2.1 LPS 结合蛋白(LPS binding protein，LBP)、CD14与内毒素耐受 当LPS进入体内后首先与血清中LBP结合形成复合物，LBP再与具有高亲和力的LPS受体CD14分子相互作用，使细胞表面的TLR4形成同二聚体并结合MD－2。此后LPS与LBP分离并与TLR4/MD－2复合物结合(MD－2负责与 LPS结合，而 TLR4与 LPS不直接相互作用［8］)。至此，TLR4被彻底激活，信号转导的大门由此打开，并经MyD88依赖型及非依赖型信号通路向下传递。研究发现在无LBP参与下，小鼠腹腔巨噬细胞也能产生内毒素耐受，提示内毒素耐受与LBP无明显相关性。亦有实验证明内毒素耐受时CD14分子并未发生实质性改变，且在CD14抗体存在的同时内毒素耐受同样能够诱导成功，故 CD14分子与LPS耐受间无直接关系。

2.2 TLR4/MyD88依赖型信号通路与内毒素耐受活化后的TLR4与细胞内含有TIR结构域的接头蛋白TIRAP(TIR domain－containing adaptor protein，TIRPAP)相互作用，募集同样含有TIR结构域的接头蛋白MyD88，MyD88通过其死亡结构域(death domain，DD)再与含有DD的IL－1受体相关激酶(IL －1 receptor associated kinase，IRAK)家族成员结合，二者相互作用导致IRAK的自身磷酸化而活化，活化的IRAK招募并激活肿瘤坏死因子受体相关因子(TNF－α receptor associated factor，TRAF)家族成员中的TRAF－6［9］。TRAF－6下游的信号通路分为2条，分别激活NF－КB诱导激酶(NF－КB inducing kinase，NIK)和有丝分裂原结合蛋白激酶(Mitogen －activated protein kinase，MAPK)家族，最终导致转录因子NF－КB和AP－1(activator protein－1)的活化。活化的转录因子转至胞核，启动相应靶基因的表达，最终导致多种细胞因子的产生［10］。

2.2.1 TLR4与内毒素耐受 Nomura等用不同剂量LPS二次重复刺激小鼠腹腔巨噬细胞以建立LPS耐受模型后发现，细胞因子的分泌与LPS的剂量及处理后的时间呈时间依赖性减少，同时TLR4的表面表达在数小时内呈梯度下降，并持续达24小时之久，证明了细胞因子的分泌下降与TLR4表达下降呈正相关。这与陈华文等［11］对预先经小剂量LPS刺激的大鼠再次予以较大剂量LPS刺激后其白细胞粘附因子及TLR4均较对照组明显下降的结论吻合。二者均充分说明了TLR4表达的下降为内毒素耐受的重要机制之一。

2.2.2 MyD88与内毒素耐受 大部分MyD88是以一种非活性形式存在于细胞骨架中，即与β肌动蛋白结合形成一种复合物［12］。当 TLR通路被激活后，肌动蛋白重排，MyD88释放至细胞质中，并被招募至TLR/IL－1R处，以此链接下游信号。虽然目前尚缺乏确切证据来显示LPS耐受时MyD88的具体变化，但早在1999年便发现MyD88基因敲除小鼠的巨噬细胞及胚胎成纤维细胞缺乏对LPS的反应性，并对LPS产生了耐受性，说明了MyD88的信号转导作用对LPS反应是基本的及LPS耐受与MyD88之间的重要关系。

2.2.3 IRAK与LPS耐受 目前已发现的IRAK家族成员有4个，分别是:IRAK－1、IRAK－2、IRAK－M和IRAK－4，其中IRAK－1和IRAK－4有激酶活性，而IRAK－2和IRAK－M无激酶活性。IRAK－1、IRAK－2、IRAK－4均在激活转录因子NF－КB中发挥重要作用，而IRAK－M却因其在TLR信号转导通路中的负性调控作用而备受关注［13］。有研究发现在对THP－1细胞进行初次内毒素刺激时，IRAK能够被快速激活，表达增加并与MyD88迅速结合;而在内毒素耐受的THP－1细胞中IRAK表达数量显著下降、IRAK的酶学活性消失且与MyD88的结合发生障碍，使内毒素诱导的信号转导受阻于此。IRAK在参与内毒素耐受机制的建立中有重要作用。

2.2.4 MAPK与内毒素耐受 MAPK家族是一组可被多种信号激活的丝/苏氨酸蛋白激酶，位于胞浆信号转导通路的末端，活化后转位至核内，并作用于相应转录因子，调节基因表达。目前被发现的MAPK亚族共有 4个:P38、ERK、ERK5以及JNK4［6］。而LPS可激活MAPK家族成员发生级联反应，促使下游分子磷酸化，进而诱导多种炎症因子和抗炎因子的基因表达。研究发现内毒素耐受小鼠巨噬细胞经LPS再次刺激时，P38、ERK等磷酸化程度均明显减弱，从而降低对LPS的过度反应。由此可知，MAPK家族与LPS耐受有着密切关系。

2.2.5 NF－КB与内毒素耐受 NF－КB是由两个亚基组成的同二聚体或杂二聚体，属于转录激活因子。在无刺激因素作用时，NF－КB杂二聚体位于胞浆中并与其抑制蛋白IКB相结合。在外界刺激因素作用下，IКB激酶(IKK)被激活，催化IКB的磷酸化，使泛素化并被蛋白酶体降解。活化的NFКB转移至细胞核内，与NF－КB反应元件相结合，调节基因表达。内毒素耐受细胞中IKK不能被激活，使IКB无法降解并持续与NF－КB结合，从而抑制NF－КB转位至胞核影响基因表达。

2.3 TLR4/MyD88非依赖型信号通路与内毒素耐受 TLR4除可经MyD88依赖途径传导信号外，亦可经MyD88非依赖途径传导。而MyD88非依赖通路转导需要含TIR的接头蛋白(TIR domain－containing adaptor－inducing IFN －B，TRIF)的参与，因此也称TRIF依赖性途径。活化后的TRIF可使IFN调节因子3(IFN regulatory factor 3，IRF3)发生磷酸化，最终诱导产生主要的转录因子［14］。LPS可以刺激MyD88缺陷的巨噬细胞表达干扰素诱导蛋白，该干扰素诱导蛋白基因的表达需要依赖TLR4，但不依赖MyD88，而是通过干扰素调节因子3和NF－КB发生的。研究表明，在此途径中TLR4先活化TRIF相关接头分子(TRIF－related adaptor molecule，TRAM)，再通过TRAM与TRIF结合。至目前为止，尚未见LPS耐受与MyD88非依赖型信号通路之间关系的具体报告，因此其也将成为LPS耐受机制的另一探索领域。

3 与内毒素耐受相关的负性调节分子

研究表明，LPS耐受除可通过TLRs通路表达下调建立耐受机制外，亦与一些负性调节分子有关。这些负性调节分子因位置分布不同，被分为膜上的蛋白和胞浆中的因子［15］。膜上蛋白包括细胞表面的清道夫受体SR－A(Scavenger receptor A)、RP－105(TLR4同源体)、以及内体膜上受体NOD2(Nucleotide－binding oligomerization domain 2)等。以上物质的负性调节作用机制均未完全阐明，研究表明，其大多数物质均与抑制TLR4通路某环节的表达或(和)分子之间的链接有关。如，SR－A可能是通过结合和吞噬LPS，减少TLR4与其配体结合而减少基因表达。而RP105则与MD－1形成复合物，然后通过MD－1直接与MD－2作用，特异性地抑制TLR4信号转导通路［16］。胞浆中的因子有MyD88s、IRAK－M、细胞因子信号传导抑制因子(suppressor of cytokine signaling，SOCS)等。MyD88s为 MyD88的同源物，缺少MyD88的中间结构域(TIR区和DD区之间的110～157个氨基酸)，此结构域的缺失使IRAK磷酸化发生障碍，进而使信号下传受阻。IRAK－M作为IRAK家族中的负性调节因子，通过抑制IRAK－4诱发的IRAK－1的磷酸化，阻止下游IRAK/TRAF－6复合体形成，导致TLRs信号中断［17］。研究发现，在小鼠内毒素耐受模型中，低剂量LPS刺激IRAK－M表达上调，而较高剂量LPS诱导时IRAKM表达则上升，提示LPS耐受与IRAK－M关系密切［18］。细胞因子信号传导抑制因子(SOCS)是新近发现的具有负性调控细胞因子产生的蛋白分子。SOCS家族已发现有8个成员，分别命名为SOCS－7和CIS，其大多均可通过负性调控JAK/STAT通路起免疫调控作用。而在众多家族成员中，SOCS－1与内毒素耐受形成的机制关系最为密切。陈先锋等［19］通过对小鼠建立内毒素耐受模型发现，实验动物在表现出对内毒素耐受的同时，其肝组织中SOCS－1基因的表达明显增强，提示SOCS－1基因的表达与内毒素耐受的形成有密切关系。

4 内毒素耐受与儿童内毒素血症及脓毒症

脓毒症是由感染所诱发的全身性炎症反应，是儿科重症监护病房(PICU)中危重患儿死亡的常见原因之一［20］。引起脓毒症的感染因素包括细菌、病毒、真菌、支原体等，其中以革兰阴性细菌感染造成的脓毒症最为常见。当机体感染革兰阴性细菌后，其释放的脂多糖进入血液，即造成内毒素血症;另外，在强有力的抗生素应用下，细菌大量死亡破坏，亦可使LPS释放造成内毒素血症。当脓毒症发生时大量细胞因子释放形成细胞因子风暴，造成机体严重损伤，其中内毒素成为刺激细胞因子产生的主要元凶，故脓毒症与内毒素血症二者之间密不可分。内毒素血症为临床常见的急危重症之一，其具有起病急，进展迅速，病死率高等特点。儿童由于其免疫系统尚未发育成熟，不能有效地将病原体或毒素局限、清除，故成为内毒素血症的高发人群。据Watson等［21］报道，在美国儿童严重脓毒症死亡率为10.3%，并成为PICU中主要死亡原因之一，其中革兰阴性菌感染所致脓毒症占据相当大部分比例，故内毒素血症亦成为儿童死亡的重要病因之一。目前对内毒素血症的治疗缺乏有效的措施已成为临床工作的一大瓶颈。而内毒素耐受的发现，在降低内毒素血症、脓毒性休克、多器官功能衰竭等所造成的死亡率上起重要作用，为临床治疗内毒素血症提供了新的思考方向。如为内毒素血症高危人群预先进行减毒LPS或LPS类似物(如单磷酸类脂A，其人体可接受的安全剂量是LPS的10000倍，比LPS具有更大的安全性)刺激，建立内毒素耐受机制，以减少内毒素血症发生时的炎症反应程度及组织损伤;另外，对已发生内毒素血症的患者，可应用对TLR4通路具有阻断作用的相关药物，以减少细胞因子的瀑布样释放，提高内毒素血症的治疗效果。如Tidswell等［22］发现大剂量 E5564(一种 TLR4阻断剂)的治疗可明显降低脓毒症患者的病死率;再者，内毒素耐受相关负性调节分子的发现，亦有可能成为内毒素血症治疗药物的新选择。

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