马铃薯种薯脱毒苗快速繁殖技术及污染防范措施

徐晓丽 李方华

（甘肃省酒泉职业技术学院生物工程系 735000）

马铃薯是我国重要的粮菜兼用作物，在我国分布广泛，但生产水平却相对较低，平均667m2产量不足1000kg，仅为发达国家平均667m2产量2500kg的1/3。影响产量的一个重要因素是马铃薯病毒，据了解，马铃薯可感染30种病毒。由于生产上是应用无性繁殖，经过多年留种种植后，体内病毒的累积使品种植株逐年变小，叶片皱缩卷曲，叶色浓淡不均，茎秆矮小细弱，块茎变形龟裂，产量逐年下降，对生产造成严重危害。由于马铃薯育种体系尚不健全，农民自留种现象普遍，生产上大约80%以上马铃薯感染病毒。目前，采用马铃薯茎尖分生组织培养是解决马铃薯种性退化最有效的方法之一，这一技术具有周期短、效率高、能与组织培养快速繁殖相结合等特点，在马铃薯生产上普遍应用。

1 脱毒苗的快速繁殖

1.1 培养基制备

冬季采用MS加赤霉素 （0.25mg/L）加奈乙酸（0.01mg/L）加 6-苄基氨基嘌呤（0.5mg/L）加泛酸钙（2g/L）加白糖3%加琼脂0.7%，用1moL/LHCI或1moL/L NaOH调节pH值至5.8～6.0（夏季6-苄基氨基嘌呤的量减至0.1mg/L）。

1.2 灭菌

配好的培养基按每瓶25～30mL分装于培养瓶中，用透气薄膜封口，旋上瓶盖，置于121℃、压力114g/cm的容器中高压蒸汽灭菌20min，并置于无菌室内待用。

1.3 无菌接种

在无菌超净工作台上，用镊子夹出经病毒检测合格的试管小植株，按节切段，每段带1片小叶，然后扦插到经灭菌后的培养基中，每瓶扦插8～12节茎段。接种完毕后，瓶口置于火焰上转动灼烧消毒，盖上封口膜，用橡胶圈扎紧，标记上品种名称和接种日期。

1.4 无毒苗培养

在温度24～26℃、日照时间12～14h/d、光照度2000～2500Lx条件下培养，待小苗长至10cm左右时，可进行下一轮快繁转接。

2 马铃薯茎尖脱毒培养过程中常见的污染问题

2.1 真菌污染

（1）培养基表面存在大量真菌污染：培养瓶瓶口封得不严或培养基存放环境真菌孢子浓度过大。（2）培养基内部存在大量真菌污染：母液储备液被污染。（3）接种室内真菌孢子浓度过大或超净工作台的滤网不干净：种后培养基表面存在真菌污染而且位置不定。（4）接种到培养基以后，在培养过程中发现外植体周围出现真菌污染：外植体材料本身带有菌。（5）培养基中发现污染的真菌是零星地分散在培养基中：人为因素造成的，如培养基和接种器具灭菌不彻底、超净工作台长时间不更换滤膜、操作不规范等。

2.2 外植体灭菌不彻底

在室外采集回来的材料，由于生长环境不干净带有很多杂菌，如果灭菌处理方法不当，导致灭菌不彻底，在接种培养2～3d后外植体周围长满细菌或真菌，或者两种菌都有。这样不但得不到预想中的结果，同时还会因为带菌而影响培养室内的其他培养材料，造成交叉感染。

3 防范措施

3.1 消灭污染源

应定期清理消毒接种室和培养室，保持环境高度清洁，保证所用容器洁净，接种室要经常用紫外线灯消毒灭菌，对已经被真菌污染的材料要经过高压灭菌后扔掉，即使仅形成菌丝也应处理后扔掉。遇到内生菌污染可通过在培养基中添加一些抑菌剂或抗生素如青霉素、链霉素等来防止和减少内生菌的污染。在马铃薯核心种苗的扩繁接种过程中，特别是在转继代培养过程中，对所要转接的马铃薯材料一定要在灯光下仔细观察，确认材料无污染。

3.2 用正确的灭菌方法进行灭菌

对马铃薯基础材料或诱导所得的芽，要先在水龙头下冲洗干净，同时拿柔软的毛刷轻刷表面，最后在超净工作台上进行灭菌处理，一般可用10%次氯酸钠溶液或0.1%升汞溶液进行灭菌。在植物组织培养过程中采用复合灭菌剂处理比使用单一灭菌剂处理灭菌效果更好。因此，在马铃薯组织培养过程中，为了增强灭菌效果，可采用混合消毒液或进行多次消毒，即用10%次氯酸钠溶液灭菌处理2～3min，再用0.1%升汞溶液灭菌处理2～3min，这样可取得很好的灭菌效果。工作人员在进行接种前要换工作服并带口罩，并用75%酒精仔细擦手，方可进行下一步工作。同时，工作人员在接种过程中要严格按照无菌操作要求进行材料转接，尽量少走动、不说话，以减少空气震动和流动，减少污染。

3.3 严格接种后的管理

在材料的培养阶段，应定期清理消毒培养室，保持培养室内空气洁净。定期用甲醛溶液、米醋或臭氧机熏蒸培养室，非工作人员应尽量少进入培养室内。一旦发现污染要及时处理，若为真菌污染，必须对污染的苗用高压锅灭菌后销毁；若为细菌污染，而且被污染的材料是比较稀少且珍贵的，可以对所污染的材料进行挽救。具体做法：将被污染的整瓶材料拿出培养室，用酒精棉盖住污染处，剪下植株顶部再次进行灭菌处理后转接到干净的培养基中。

马铃薯脱毒效率直接影响到马铃薯原原种的质量，如果采取合适的手段提高脱毒效果，马铃薯原原种的质量会明显提高，所以茎尖培养脱毒育种是一种很有潜力的方法。