血管内皮糖萼研究进展

姚杏红 曾 烨

1（中山大学肿瘤防治中心放疗科，华南肿瘤学国家重点实验室，广州 510060）

2（四川大学华西基础医学与法医学院生物医学工程研究室，成都 610041）

心血管病严重危害着人类的生命健康，近年来一直高居我国居民主要疾病死亡率的榜首［1］。研究行之有效的心血管病防冶策略是国家的重大战略需求。心血管系统是一个以心为核心，血管网络遍布全身的生物力学系统。流体力学因素，如剪切力（shear stress）通过调控内皮细胞力传导机制，进而影响血管张力、血凝过程、免疫和炎症反应、血管生成与重建等功能及维持内环境稳态。内皮细胞感受剪切力、将剪切力信号转导入细胞内引起分子信号级联反应，最终做出应答的机制即力传导机制。力传导机制是近年来医学领域研究的一大焦点。

过去20年，通过研究内皮细胞已知受体／感受器在剪切力调节内皮细胞形态与功能中的作用，探明了一些与力学信号传导相关的内皮结构蛋白和受体，它们通称为力学感受器（mechanosensor）。这些潜在的力学感受器主要包括血管内皮糖萼（endothelial glycocalyx）、离子通道（例如Ca2＋通道）、细胞骨架（cytoskeleton）（例如微管、肌动蛋白和中间丝）、G 蛋白耦联受体（例如白介素－8 受体CXCR1和CXCR2）、酪氨酸激酶受体（例如血管内皮生长因子受体flk－1（fetal liver kinase 1））和粘附蛋白分子（例如血管内皮细胞钙黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VE－cadherin），血小板内皮细胞黏附分子－1（platelet endothelial cell adhesion molecule－1，PECAM－1）和αvβ3 整 合素）等［2－6］。这些力学 元 件分布于内皮细胞的不同部位，其中血管内皮糖萼附着于内皮细胞表面与血液直接接触。

最新研究表明，作为力学感受器家族中最新的一员，内皮糖萼在维持正常的心血管功能中扮演着非常重要的角色。血管内皮糖萼层的破坏与动脉粥样硬化、肥胖、肿瘤转移等众多疾病的发生密切相关。人们逐渐领悟到血管内皮糖萼在生理与病理过程中的重要性，对血管内皮糖萼的结构与功能的研究及其调控正在成为生命科学研究中值得深入的新热点。

1 血管内皮糖萼的结构

血管内皮糖萼是血管内皮腔侧表面覆盖着的一层多糖－蛋白质复合物。对内皮细胞表面的这层活性物质的认识可追溯到半个世纪前，1966年Luft［7］采用电子显微镜技术首次显示了血管内皮糖萼，但受技术条件限制，至今对其组成与功能等仍知之甚少。目前，研究者们总结过去十数年的研究，认为血管内皮糖萼主要包括蛋白聚糖（proteoglycan，PG）及其上糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）链等。GAG 为糖萼中含量最多的成分，主要包括：硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）、硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CS）和透明质酸（hyaluronic acid或hyaluronan，HA）等三种。在血管系统中HS最多，占GAG 总量的50%以上。内皮细胞顶面（apical surface）的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPG）主要包括跨膜syndecan 家族、糖磷脂酰肌醇（glycophosphatidylinositol，GPI）锚定的glypican家族。Syndecan家族中，内皮细胞syndecan－1可与HS和CS结合［8］，与剪切力关系最密切［9］。Glpyican－1 是唯一在内皮细胞上表达 的glypican家族成员，它与syndecan－1不同，只链接有HS链，而没有CS链［8］。HA 是非硫酸化的GAG，它不与PG 核心蛋白相连，与受体CD44结合。目前研究认为，胞膜窖（caveolae）与脂筏（lipid raft）为两种不同的膜筏（membrane raft）［10，11］，syndecan－1为跨膜蛋白，锚定于膜筏外的膜区域，而glypican－1则位于膜筏上（包括胞膜窖与脂筏）。

2 血管内皮糖萼的功能

血管内皮糖萼强烈影响内皮细胞功能，可调节血细胞与内皮细胞的相互作用，为维持血管内皮细胞的正常结构与功能所必须，它贡献于血－组织通透性屏障的形成［12－14］，是血流作用力的力学感受器［10，15］，并可防止白细胞在内皮细胞上的粘附［16］等，在多种生理学过程中发挥着重要作用。当前研究认为，糖萼的各成分维持着合成与降解的动态平衡，糖萼结构的破坏会对其功能产生极大影响。糖萼的主要功能有：

（1）血管壁的选择性通透屏障

带负电荷的内皮糖萼与吸附的血浆蛋白位于血液和内皮细胞之间，通过限制液体和血浆大分子向内皮细胞膜转运，维持体液平衡，构成了血管壁的天然选择性通透屏障。研究表明，大分子右旋糖酐不能透过糖萼，而小分子的则容易透过［17］。糖萼破坏后，血管壁通透性增加［18］。目前认为，糖萼变化引起的通透性改变与细胞间连接这一影响通透性的主要结构无关。

（2）调节血细胞与血管内皮细胞的相互作用

内皮糖萼的存在，限制了白细胞、血小板和红细胞与内皮细胞的接触［16，19］。糖萼破坏以后，白细胞与内皮细胞的相互作用增加。目前认为，糖萼对白细胞与内皮细胞相互作用的调控与两个方面有关：一方面与可降解糖萼的细胞外蛋白酶（Extracellular Proteases）密切相关［16，19］，主要是基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteases，MMPs）；另一方面，它掩盖或减弱了内皮细胞表面的粘附分子如ICAM－1等。研究表明，动脉粥样硬化早期发生事件伴随内皮表面糖萼的损伤，使血管壁粘附性增加。

（3）参与力传导

糖萼在内皮细胞力学信号传导中扮演着重要角色［20－23］。2003年，Weinbaum 等通过理论分析，指出糖萼的存在可将细胞表面的剪切力消弱至一个可忽略的水平，剪切力矩可通过PG（如syndecan－1）的跨膜域传递到膜下肌动蛋白骨架，继而触发细胞内分子信号级联反应［24］。2004年，Weinbaum 等的实验结果进一步表明，糖萼破坏以后，细胞骨架对剪切力的应答被抑制，而细胞连接却几乎不受影响［25］。选择性移除特定糖萼GAG 可抑制剪切力诱导的牛主动脉内皮细胞的NO 生成［26－28］。

（4）作为控制中心调节血管局部微环境稳定

糖萼GAG 链形成的非均相表面（heterogeneous surface）［29］为大量血源性分子的停泊提供了可能，并通过三种途径影响着局部微环境：一是受体或者酶及其配体在内皮糖萼上的结合造成其局部浓度的升高，如糖萼结合有脂蛋白脂肪酶及其配体低密度脂蛋白；二是血源性分子在糖萼上的结合可能会形成局部的浓度梯度；三是酶及其激动剂或抑制剂的停泊，增加了血管内皮糖萼的血管保护功能。

3 血管内皮糖萼的常用研究技术

近年来，流式细胞术、激光共聚焦荧光显微镜、电子显微镜和活体显微术的应用发展为内皮糖萼结构，特别是糖萼GAG 的深入研究提供了技术手段。综合运用多种方法可检测细胞表面的糖萼结构与分布情况。

（1）电子显微镜

内皮糖萼的显示最先是利用钌红（Ruthenium Red）染色实现的，其测得的厚度约为20nm。但钌红可能会通过静电作用影响糖萼的几何结构，且分子较大，难以与糖萼分子完全接触。为了克服该缺点，使用小分子阿利新蓝（Alcian Blue）作为染料，测得糖萼厚度在45～80nm，而该法的缺点则是需洗去黏附的血浆蛋白，这一过程可能使糖蛋白的核心蛋白被溶解。随后，通过使用碳氟化合物作为锇酸溶剂的方法更好地减少了固定对糖萼结构的破坏，使显示厚度达60～110nm。

（2）活体显微术

由于电子显微镜法中标本制备和染色会严重破坏富含水分的糖萼结构，在20世纪70年代后期，开始使用活体定量研究为糖萼厚度测定提供间接依据。该方法将糖萼视作红细胞与内皮细胞间的“隔离层”，测定该“隔离层”的范围间接测得糖萼厚度为数百纳米。

尽管活体显微术显示法不会破坏糖萼完整性，但却不能用于体外培养细胞的研究。对于体外培养内皮细胞表面糖萼层进行电子显微镜测定时需要采用特殊处理尽可能恢复和保存糖萼层的完整性。最近，Ebong等利用冷冻电子显微镜技术观察到了体外牛主动脉内皮细胞上厚度为5μm 的糖萼。

（3）流式细胞术

最近，Koo和Dewey 等［9］利用流式细胞术，检测了人脐静脉内皮细胞表面糖萼成分在流动波形剪切力长时间作用下的合成情况。该方法的优点是灵敏度高，缺点是需要将体外培养的内皮细胞分离成单个细胞，对内皮糖萼层的破坏有待评估。

（4）激光共聚焦荧光显微镜

我们先前利用激光共聚焦荧光显微镜对内皮糖萼的成分、结构及其在剪切力作用下的变化进行了研究［10，30－32］。但受显微镜的Z轴分辨率的限制，该方法无法准确显示糖萼的厚度。

而对于血管内皮糖萼功能的认识，当前主要是通过选择性降解酶作用糖萼的特定成分，特别是GAGs，然后分析整个细胞功能的变化。

4 剪切力诱导血管内皮糖萼的特异重构

最近两年，我们在剪切力诱导血管内皮糖萼结构重建方面获得了一些研究成果。血管内皮糖萼在剪切力作用下的改变可分为急性改变与适应性改变。急性改变［10］：15dyn／cm2生理剪切力作用内皮细胞30分钟后，部分glypican－1及其结合的HS呈现聚集现象，而跨膜syndecan－1 及其上附着的HS和CS，以及部分glypican－1则固定不动。适应性改变［32］：剪切力持续作用至24 小时后，HS 重新覆盖细胞单层表面，这与在完全适应条件下的大鼠与小鼠主动脉中相似［33］。同时，值得注意的还有细胞骨架的变化，30 分钟时，肌动蛋白纤维微丝在细胞顶部和底部均有增加；而24小时后，长应力纤维形成并主要集中分布于细胞顶部，细胞底部的肌动蛋白纤维微丝增加，但排布凌乱。利用cytochalasin D 扰乱肌动蛋白的重构，我们发现24小时以后的HS的合成与重新分布被阻止，而前30分钟的聚集现象依然明显存在。现有研究表明，肌动蛋白细胞骨架为维持胞膜窖稳定［34］所必须，同时与syndecan－1跨膜域有相互作用［35］。上述扰乱肌动蛋白的重构废除了血管内皮糖萼的适应性重构现象，其产生的原因似乎是cytochalasin D 仅破坏了细胞骨架与syndecan－1及胞膜窖的相互作用，但不影响脂筏。

研究表明，急性与慢性改变的剪切力对内皮细胞的力学传导［36，37］与内皮通透 性［38，39］具有不 同作用。急性改变的剪切力（15dyn／cm2 作用30 分钟）可诱导NO 表达水平显著增加［10］。急性改变的剪切力（10dyn／cm2作用30分钟）活化细胞顶面的β1整合素［40］；阻断β1 整合素的活化可废除剪切力诱导的PI3K－Akt－eNOS信号级联这一与NO 表达密切相关的胞内信号通路；急性剪切力诱导的这些变化依赖于胞膜窖的完整性，不依赖于肌动蛋白细胞骨架。肌动蛋白细胞骨架似乎与急性改变的剪切力诱导的NO 无关。

综上所述，研究血管内皮糖萼的结构与功能，对阐明剪切力调控内皮细胞结构与功能的力传导途径具有重要意义。急性改变的剪切力诱导的血管内皮糖萼重构与NO 的表达均不依赖肌动蛋白细胞骨架。而血管内皮糖萼在NO 表达中有着重要作用，不可否认，通过深入认识血管内皮糖萼的重构机理，可以帮助我们更好地认识剪切力诱导内皮细胞NO表达的作用机理，进而帮助我们更好地保护血管，预防和冶疗心血管疾病。

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