DNA条形码——性二型蚤蝇鉴定的有力工具

申熙熙，王剑峰，刘广纯

（沈阳大学 城市有害生物治理与生态安全辽宁省重点实验室，辽宁 沈阳 110044）

蚤蝇科是双翅目中较大科之一，目前世界已记录大约4 000种，但实际种类可能达该数量的10倍［1］.蚤蝇幼虫食性分化明显，有肉食、腐食、尸食、粪食和植食等多种取食类型，许多种类与人类关系密切.蚍蚤蝇属Pseudacteon种类，成虫产卵于入侵红火蚁Solenopsis invicta 颈部，幼虫孵化后迅速侵入寄主头部取食，致其头部脱落、死亡，称为斩首蚤蝇（decapitating flies）.斩首蚤蝇是目前发现的最有应用前景的控制入侵红火蚁的天敌资源，部分种类已在美国南部成功繁殖释放［2-3］.异蚤蝇属 Megaselia种类，如 M.halterata，M.agarici，M.sandhui等幼虫以担子菌类为食，是食用菌养殖业的重要害虫［4］；尸食性种类如蛆症异蚤蝇M.scalaris 等能引起人类蝇蛆病［5］，同时也是法医昆虫学的重要组成部分.

蚤蝇性二型现象非常普遍，目前50%以上的属为单性属［6］.而占据蚤蝇约45%的异蚤蝇属，在已知的1 500多种中超过60%的种类是以单性种发表，其中雄性种占到59%.在虼蚤蝇属Puliciphora 中，雄虫一般有翅，但雌虫翅退化或无翅，这可能是由于雌虫需要消耗更多的能量以用于生殖，而翅退化或无翅可以节省飞行能量；再如栅蚤蝇属 Diplonevra和栓蚤蝇属Dohrniphora 两属中雄虫的喙常是典型的舐吸式，而雌虫则为或短或长的刺吸式，这种差异同雌雄个体的食性不同有关.另外，蚤蝇雌雄个体间的差异还表现在触角类型、足、腹部气门与背板、体型大小等许多方面［7］.性二型现象给蚤蝇的分类鉴定、系统发育研究，以及相关的经济发展带来很大困难.

本文介绍了蚤蝇的性二型现象和由此带来的问题，综述了动物性二型的研究方法，着重分析讨论了应用DNA 条形码技术解决性二型乃至多型昆虫鉴定、雌雄配对难题的可行性.

1 蚤蝇性二型现象带来的问题

常规的分类鉴定主要依据形态上的差异来区分不同的阶元.在早期的蚤蝇分类鉴定中，雌雄性均可作为模式确定新物种.由于性二型的存在造成很多同物异名.如Spiniphora genitalis 是Schmitz于1940年依据雄性标本确立的新种，而Spiniphora variegata 是Borgmeier于1961 年依据雌性标本描述，直到2001年两者才被确定为同物异名关系.再有Brown通过饲养发现仅有雄性种类的Gymnoselia 和仅有雌性种类的Rhynchomicropteron为同属.就是说，被认为两个属的种类，其实是雌雄两性而已.

性二型现象不仅带来物种鉴定方面的难题，更重要的是，大量性二型蚤蝇的存在还将干扰蚤蝇科系统发育关系的重建.目前蚤蝇高级阶元系统发育关系混乱，争议颇多，一个重要原因是物种鉴定不准确.性二型引起的鉴定错误还会直接影响到害虫有效控制、法医的准确侦破，以及天敌的合理利用，从而对经济造成损失.

2 性二型、多型现象的研究方法与现状

2.1 传统形态学方法

长期以来，动物性二型现象一直是困扰各类群种类有效鉴别的难点之一.早期对于性二型现象的研究主要基于外部形态多变量的测量与统计分析.在比较性二型差异时，常采用对外部形态特征进行定性定量分析的方法.由于定性分析只对器官结构进行形态描述和比较，不易得出准确有力的结论，因而需要进行定量的研究［8］.潘汝亮、王红等采用定量测定的方法对大型灵长类动物短尾猴下颌骨［9］和金丝猴肩带、前肢［10］的性二型进行研究.近年，随着测量手段更为丰富，结果较之前也更准确些，如熊文华、安晓雷等分别采用电子称重［11］、X 射线扫描法［12］等方法从体重、头骨形态、脑内结构等方面对哺乳类中鼠的性二型现象进行了研究分析.在衡量性二型程度方面，若只针对某一变量，可把变量进行对数处理后再进行百分比比较［13］，或直接用雌性变量占雄性变量的比例进行比较.若要对某一器官的多变量进行综合分析，则需要使用统计学公式，不同的作者所使用的公式、方法不同［14］.在进行种间性二型差异分析时，可以采用如多维模式、Q 模式系统聚类分析、图论聚类、Andrews多维表象法等方法［15］.

在上述的研究中，不难发现其中所研究对象均为已确定种类，研究也大都从外部特征方面探讨性二型现象，采用的方法是观察测量和统计学方法处理数据.但是单靠测量和统计方法有其自身的局限性，如测量结果存在人为差异等.面对形态复杂且缺乏有效形态特征的昆虫种类或是由于雌雄种类存在明显差异而导致无法断定为同一种类的昆虫，此方法明显不适用，当然也无法解决因性二型而导致的雌雄个体无法配对的问题.

2.2 电镜与生理生化指标方法

各项生物技术尤其是显微技术和生物化学、细胞学的发展，为解决由性二型现象所带来的问题提供了新的可能性.在小型昆虫类中，使用扫描电镜和透射电镜对不同雌雄昆虫（如青杨脊虎天牛［16］、笋秀夜蛾［17］等）的触角感器进行观察，可从高倍电子显微水平观察到一般方法难以观察到的雌雄差异.还可以通过生物化学方法定性或定量测定体内代谢产物和各种激素如保幼激素、蜕皮激素等的含量来寻找解决问题的途径，如张保常等通过研究发现长翅型沙蟋体内的总脂、三磷酸甘油酯等主要用于飞行的能量物质含量较高，而在短翅型沙蟋的体内则是卵巢发育所需要的磷脂含量较高［18］.对于散居型蝗虫较群居型蝗虫体色出现变异的现象进行研究发现这与散居型若虫的咽侧体分泌保幼激素有关［19］.同时，染色体核型、带型分析也影响和推动了性二型昆虫鉴定问题的解决，如田润刚尝试采用细胞学手段，通过对尖三刺角蝉的染色体核型比较，解决了三刺角蝉由于雄性个体不具上肩角，极易被误认为是秃角蝉属的种类，从而造成错误鉴定的问题［20］.

这些技术的运用不仅丰富了研究的手段，同时也使得对性二型现象的研究从单研究外部形态转变到同内部结构相结合的阶段，解决了一些单依靠外部形态难以解决的问题.但是这些技术如染色体核型分析所需工作量大，专业性强，不利于快速准确地解决大量的性二型昆虫的鉴定、雌雄匹配问题，也不是理想的方法.

2.3 DNA条形码技术

DNA 条形码（DNA barcoding）技术作为近几年新兴发展起来的一项物种鉴定技术，受到越来越多的关注和认可.

DNA 条形码的原理很简单，就如同零售业中商品条形编码一样，每一个物种的DNA 序列都是唯一的.DNA 序列是由A、T、C、G 4种碱基组成，一段有n 个碱基对（bp）的序列就有4n种编码方式，那么理论上15bp的序列就有近10亿种序列编码方式，这个数量远远超过了目前估计的物种数量［21］.若考虑进化中自然选择的压力和氨基酸密码子的简并性使得编码方式减少，一条45bp的DNA 序列可以获得将近10 亿种可能的编码方式.应用现代分子技术，想要获得一段几百个bp序列已经不是难事.同传统的形态学手段相比较，DNA 条形码技术在物种鉴定方面不受表型可塑性和遗传可变性的干扰，也不受物种性别和发育阶段的限制.同时，DNA 条形码技术标准化的操作、数字化的数据便于简单、高效、快速地对物种进行鉴定，还可以解决仅靠形态学手段难以解决的性二型、雄性多型和隐存种的问题.

Herbert就曾运用DNA 条形码证实了广泛分布于哥斯达黎加的一种鳞翅目昆虫（Astraptes fulgerator）实际上至少为10个种的集合［22］；Vaglia 等运用DNA 条形码技术发现天蛾科（Sphingidae）中的隐存种［23］.DNA 条形码技术对隐存种的发现说明该项技术可以将外部形态特征看似无明显差别的种类区分开来，从而可以解决一些传统形态分类学难以解决问题.如在蚜虫类昆虫中，由于寄主变化等原因个体常常存在多型现象，从而给物种鉴定带来困难，张合彩等运用线粒体COI基因成功解决了多型蚜虫的鉴定难题［24］；生活在榕树隐头花序中的榕小蜂被认为具有典型的雄性多型现象，有甚者有极端的性二型现象，如其中小蜂Philotrypesis属的一个雌虫形态种能有7个不同的雄虫形态种与之对应，应用DNA 条形码技术成功将存在极端的性二型和雄性多型现象的榕小蜂鉴定到种级水平，同时解决了95%以上榕小蜂雌雄配对问题［25］.DNA 条形码技术对各类群中多型、二型问题的解决和隐存种的发现，为解决性二型蚤蝇物种鉴定和雌雄匹配问题提供了一种有效的方法.

3 DNA 条形码在蚤蝇种类鉴定中的应用

面对由性二型现象造成的单性属种难配对问题，许多蚤蝇专家早有意识并曾尝试解决，如对异蚤蝇属Megaselia 和蚤蝇属Phora 雄性尾器进行了更深入的解剖研究，补充说明了尾器在分类鉴定中的作用［26-27］，但面对某些形态特征十分复杂，尤其是雌雄虫存在明显差异的物种，配对问题无法解决.

近年来，蚤蝇学家应用短片段DNA 序列（如COI、16SrRNA 等）进行了相关尝试研究，如Boehme利用COI序列成功鉴定了腐生蚤蝇6种［28］，促进了法医鉴定与其相关工作；Brown等联合分析2种核基因（28SrRNA 和CAD）和4种线粒体基因（12SrRNA，16SrRNA，ND1和COI）并结合形态学特征，对寄生于蜜蜂的Melaloncha属蚤蝇进行了系统发育研究［29］.Cook 等则着眼于性二型蚤蝇，利用线粒体16SrRNA 基因的一小段序列对性二型蚤蝇进行研究，并成功将雌雄配对［30］；在此之后Smith等应用多基因联合分析来进行雌雄匹配，结果更准确可信［31］.这些尝试证明了应用短片段DNA 序列解决蚤蝇性二型配对问题的有效性与可行性，为蚤蝇属、种的订证及系统发育关系研究提供了新的思路与方法.

4 结 语

开展蚤蝇性二型DNA 条形码研究不仅能解决传统形态分类学难题，而且能为蚤蝇科系统发育关系的重建提供有力的依据.同时，许多蚤蝇种类同人类生活生产息息相关，应用一个短片段的DNA 条形码快速准确地鉴定蚤蝇种类，对生物防治、口岸检疫以及法医鉴定等工作都具有重要的借鉴和指导意义.

［1］Brown B V.Diversity of Ant-decapitating Flies（Dipera：Phoridae：apocephalus）from the ALAS Project：NewResultsand Projections［J］.Sociobiology，2004，44（3）：683-688.

［2］Feener D H，Brown B V.Reduced Foraging of solenopsis geminata（Hymenoptera：Formicidae）in the Presence of Parasitic pseudacteon spp.（Diptera：Phoridae）［J］.Annals of the Entomological Society of America，1992，85（1）：80-84.

［3］Gilbert L E，Barr C E，Alejandro A，et al.Introducing Phorid Fly Parasitoids of Red Imported Fire Ant Workers form South America toTexas：Outcomes Vary by Region and by pseudacteon Species Released［J］.Southwesyern Entomologist，2008，33（1）：15-29.

［4］Coles P S，Barber W.Handbook for Mushroom Integrated Pest Management ［M］.University Park：The Pennsylvania State University，2002：25-32.

［5］刘广纯，陈琳，何小慧，等.东亚异蚤蝇生活史研究［J］.沈阳大学学报，2001，13（2）：1-2.（Liu Guangchun，Chen Lin，He Xiaohui，et al.Life History of megaselia spiracularis Schmitz（Diptera：Phoridae）［J］.Journal of Shenyang University：Natural Science，2001，13（2）：1-2.）

［6］Disney R H L.Scuttle flies：The Phoridae［M］.London：Chapmann ＆ Hall，1994：469.

［7］刘广纯.中国蚤蝇分类 双翅目：蚤蝇科（上册）［M］.沈阳：东北大学出版社，2001：292.（Liu Guangchun.A Taxonomic Study of China Phorid Flies（Diptera：Phoridae）（Part1）［M］.Shenyang：NEU Press，2001：292.）

［8］Schultz D H.Sex Differences in the Pelvis of Primates［J］.American Journal of Physical Anthropology，1949，7（3）：401-424.

［9］王红，潘汝亮，彭燕章，等.短尾猴下颌骨的性二型［J］.兽类学报，1992，12（3）：161-165.（Wang Hong，Pan Ruliang，Peng Yanzhang，et al.Sexual Dimorphism in Mandibular Dimensions of Macaque［J］.Acta Theriologica Sinica，1992，12（3）：161-165.）

［10］潘汝亮，何远辉，彭燕章，等.金丝猴肩带和前肢的性二型［J］.动物学报，1989，35（1）：96-103.（Pan Ruliang，He Yuanyao，Peng Yanzhang，et al.Sexual Dimorphism in Scapula and Foreleg of Golden Monkey［J］.Acta Zoological Sinica，1989，35（1）：96-103.）

［11］熊文华，张知彬.饶阳地区三种农田啮齿类头骨形态比较及性二型［J］.兽类学报，2007，27（3）：280-283.（Xiong Wenhua，Zhang Zhibin.Sexual Dimorphism and Comparisons of Skullmorphology Among Three Rodent Species in Raoyang County，Hebei Province，China［J］.Acta Theriologica Sinica，2007，27（3）：280-283.）

［12］安晓雷，申文，任宝军，等.棕色田鼠和沼泽田鼠脑内部结构性二型的比较研究［J］.陕西师范大学学报：自然科学版，2006，34（23）：134-137.（An Xiaolei，Shen Wen，Ren Baojun，et al.Comparison of the Sexual Dimorphism of Brain Structure Between Mandarin Vole（Microtus mandarinus）and Reed Vole（M.fostis）［J］.Journal of Shanxi Normal University：Nature Science Edition，2006，34（23）：134-137.）

［13］Simson G G.Large Pleistocene Felines of North America［J］.American Museum Novitates，1941：1136.

［14］Smith F H.Sexual Differences in European neardetul cranium with Specia References to the Krapina Remain［J］.Human Evolution，1980，9（3）：359-375.

［15］潘汝亮，彭燕章，叶智彰，等.灵长类性别二态的比较方法及其变异和进化的数学模式［J］.人类学学报，1988，7（4）：376-382.（Pan Ruliang，Peng Yanzhang，Ye Zhizhang，et al.Comparative Method of Primates'Sexual Dimorphism and its Mathematical Model of Variation and Evolution［J］.Acta Anthropologica Sinica，1988，7（4）：376-382.）

［16］程红，严善春，徐波，等.青杨脊虎天牛触角感器的分布特征及特殊的感器类 型［J］.昆 虫知识，2008，45（5）：743-749.（Cheng Hong，Yan Shanchun，Xu Bo，et al.Antennal Sensilla of Xylotrechus rusticus and Their Distribution［J］.Chinese Bulletin of Entomology，2008，45（5）：743-749.）

［17］邓顺，舒金平，董双林，等.笋秀夜蛾触角感器的扫描电镜观察［J］.林业科学，2010，46（12）：101-105.（Deng Shun，Shu Jinping，Dong Shuanglin，et al.Observation of Antennal Sensilla of Apamea apameoides with a Scanning Electronic Microscope［J］.Science Silvae Sinicae，2010，46（12）：101-105.）

［18］张保常，赵章武.沙蟋翅多型性的调控机理［J］.昆虫知识，2009，46（1）：5-11.（Zhang Baochang，Zhao Zhangwu.The Regulatory Mechanisms of the Wing Polymorphism for Gryllus firmus［J］.Chinese Bulletin of Entomology，2009，46（1）：5-11.）

［19］王方海，刘永平，张琼秀，等.蝗虫多型现象的神经内分泌调控［J］.昆虫学报，2004，47（5）：652-658.（Wang Fanghai，Liu Yongping，Zhang Qiongxiu，et al.Neuroendocrine Mechanisms Regulating Locust Phase Polymorphism［J］.Acta Entomologica Sinica，2004，47（5）：652-658.）

［20］田润刚，袁锋.尖三刺角蝉的核型与性二型现象（同翅目：角蝉科）［J］.昆虫分类学报，1995，17（3）：197-200.（Tian Rungang，Yuan Feng.Karyotype and Sexual Dimorphism in Tricentrus acuticornis Funkhouser（Homoptera：Membracidae）［J］.Entomotaxonomia，1995，17（3）：197-200.）

［21］肖金花，肖辉，黄大卫.生物分类学的新动向DNA 条形编码［J］.动物学报，2004，50（5）：852-855.（Xiao Jinhua，Xiao Hui，Huang Dawei.DNA Barcoding：New Approach of Biological Taxonomy ［J］.Acta Zoologica Sinica，2004，50（5）：852-855.）

［22］Hebert P D N，Penton E H，Burns J M，et al.Ten Species in One：DNA Barcoding Reveals Crytic Species in the Neotropical Skipper Butterfly Astraptes fulgerator［J］.PNAS，2004，1019（41）：14812-14817.

［23］Vaglia T，Haxaire J，Kitching I J，et al.Morphology and DNA Barcoding Reveal Three Cryptic Species Within the Xylophanes neoptolemus and Loelia Species-groups（Lepidoptera：Sphingidae）［J］.Zootaxa，2008，1923：18-36.

［24］Zhang H C，Zhang D，Qiao G X.Association of Aphid life Stages Using DNA Sequences：A Case Study of Tribe Eriosomatini（Hemiptera：Aphididae：Pemphiginae）［J］.Insect Science，2008，15（6）：545-551.

［25］李艳伟.DNA 条形码在中国榕小蜂中的应用研究［D］.山东农业大学，博士学位论文，2009：143.（Li Yanwei.DNA-based Research on Pollinating Wasps（Hymenoptera：Agaoninae）［D］.Tai'an：Shandong Agriculture University.2009：143.）

［26］Goto T.Systematic Study of the Genus Phora Latreille from Japan（Diptera：Phoridae）［J］.Kontyu，1986，54（1）：128-142.

［27］Robinson W H.Terminalia of North American Species of Megaselia（Aphiochaeta）and Descriptions of Two New Species（Diptera：Phoridae）［J］.Proceedings of the Entomological Society of Washington，1978，83（3）：489-504.

［28］Boehme P，Amendt J，Disney R H L，et al.Molecular Identification of Carrion-breeding Scuttle Flies（Diptera：Phoridae）using COI Barcodes［J］.International Journal of Legal Medicine，2010，124（6）：577-581.

［29］Brown B V，Smith P T.The Bee-killing Flies，Genus Melaloncha Brues（Diptera：Phoridae）：A Combined Molecular and Morphological Phylogeny［J］.Systematic Entomology，2010，35（4）：649-657.

［30］Cook C E，Mostovski M B.16S Mitochondrial Sequences Associate Morphologically Dissimilar Males and Females of the Family Phoridae（Diptera）［J］.Biological Journal of the Linnean Society，2002，77（2）：267-273.

［31］Smith P，Brown B.Utility of DNA Sequences for Inferring Phylogenetic Relationships and Associating Morphologically Dissimilar Males and Females of the Beekilling Flies，Genus Melaloncha（Diptera：Phoridae）［J］.Annals of the Entomological Society of America，2008，101（4）：713-721.