食管癌Eca109单克隆细胞株的干细胞特性研究

赵生霞，黄燕燕，慕晓玲

（石河子大学医学院／新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，石河子832002）

食管癌是严重危害人类健康的常见消化道恶性肿瘤之一，由于早期确诊率低，即使手术切除，预后仍较差，易复发，全世界每年约有30万人死于此类疾病［1］。目前针对食管癌的研究还处于止步不前的现状。Mackilop等［2］提出的肿瘤干细胞理论，认为肿瘤细胞中存在不同的细胞亚群，只有少数的细胞亚群具有类似干细胞的特性，在肿瘤形成、生长、浸润、复发和转移中起到重要作用。因此，分离、筛选出增殖和侵袭能力均较强的细胞，将对发现肿瘤干细胞及指导肿瘤临床治疗具有重要的意义。

本课题组许健等［3］发现食管癌TE－1细胞中存在P75NTR、Oct－4表达定位不同的情况，三氧化二砷诱导后核表达阳性的细胞相对增多，推测P75NTR、Oct－4核表达阳性的食管癌细胞可能为食管癌干细胞。

本文将继续从细胞形态、肿瘤相关标志物表达及干细胞相关特性等方面对食管癌Eca109细胞进行进一步研究。

1 材料与方法

1．1 材料

食管癌Eca109细胞株购自中国上海生命科学研究院细胞资源中心。

高糖DMEM培养液（Gibco公司）；胎牛血清（Gibco公司）；兔抗人P75NTR多克隆抗体（Millipore公司），兔抗人 Oct－4多克隆抗体（Cell signal，2750#），山羊抗兔IgG－FITC二抗（北京博奥森生物技术有限公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）及胰酶（美国Sigma公司）；LSM－510激光共聚焦显微镜（德国Carl Zeiss公司）；24孔Tanswell小室（millipore公司）；1．2μm孔径 Matrigel Matrix基质胶（BD公司）。

1．2 方法

1．2．1 Eca109细胞单克隆培养及HE染色

当Eca109细胞生长密度大于80%时，用0．25%胰蛋白酶（含0．02%EDTA）消化，加入高糖DMEM培养液制成单细胞悬液并计数，将其稀释成为3～5个细胞／mL的细胞浓度。加入明胶包被的96孔板中，每孔0．1mL，置于37℃、5%CO2培养箱进行培养6～12h。待细胞下沉并贴于培养孔底后，置相差倒置显微镜下观察，标记含1个细胞的孔。

继续培养1～2周，待被标记孔内细胞生长至50个细胞，选择生长良好的圆形克隆团传至48孔板，继续培养扩增，依次传至24、12、6孔板，最后传至培养瓶，达到实验需要细胞量。取对数生长期的Eca109单克隆细胞株分别接种于铺有盖玻片的6孔板中，待细胞生长至密度大于80%左右，行常规HE染色。

1．2．2 免疫细胞化学法检测P75NTR、Oct－4在食管癌Eca109单克隆细胞株中的表达

1）将克隆的细胞株分别用0．25%胰蛋白酶（含0．02%EDTA）消化，制成单细胞悬液，吸取6000～8000个细胞接种至放有盖玻片的6孔板中。

2）隔日加4%多聚甲醛固定，冲洗干净后用30%H2O2与纯甲醇的混合液灭火内源性过氧化物酶。

3）蒸馏水泡洗（2min／次×3）后滴加山羊血清封闭液封闭20min。

4）滴加稀释好的一抗，放置4℃冰箱过夜。

5）PBS溶液泡洗（2min／次×3）后滴加第二抗体，于湿盒中37℃孵育30min。

6）PBS溶液泡洗（2min／次×3）后加DAB液进行显色反应，适时用流水冲洗即终止显色反应。7）用苏木素染液复染胞核约2min。8）脱水、透明、封固。显微镜观察。

1．2．3 MTT法测细胞增殖情况

1）单克隆Eca109细胞的接种和培养，分别取对数生长期的细胞经胰酶消化后，用含10%FBS的高糖DMEM稀释为1×104／mL。

2）以每孔100μL接种于96孔板中，然后放入37℃、5%CO2培养箱中培养24h。

3）每孔加20μL MTT液，继续培养4h。

4）吸弃每孔内液体后加100μL DMSO，震荡10min，待细胞内蓝紫色结晶完全溶解。

5）设空白对照组调零后，用酶联免疫检测仪于490nm波长处检测各孔的吸光度值（OD值），连续监测7d，记录结果并进行统计，描绘细胞生长曲线。

1．2．4 平板克隆形成实验

1）取对数生长期的细胞，用0．25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，终止消化后计数。

2）以300个细胞的密度接种于6孔板中，每个细胞株设2个复孔，轻轻转动使细胞分散均匀，置37℃5%CO2及饱和湿度的培养箱中，静置2周。

3）当孔板中出现肉眼可见的克隆时终止培养，弃去培养液，用PBS缓冲液浸洗2次。

4）加4%多聚甲醛固定15min，然后去固定液，加适量的苏木素染液染5－10min，最后流动水缓慢洗去染液，空气干燥。

5）显微镜（低倍镜）计数大于50个细胞的克隆数，计算克隆形成率，克隆形成率＝（克隆数／接种细胞数）×100%。

1．2．5 Transwell细胞侵袭实验

1）包被基质胶。用50mg／L Matrigel 1∶5稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。

2）水化基质胶。吸出培养板中残余液体，每孔加60μL含10g／L BSA的无血清培养液，37℃30min。

3）制备细胞细胞悬液。用无血清培养液调整细胞密度，每孔接种1×105，上室加100μL无血清培养液，下室加600μL含20%FBS的培养液，去除气泡，培养48h。

4）用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，苏木素染色15－20min，伊红染2min随机选取5个200×视野的细胞计数。

2 结果

2．1 食管癌Eca109单克隆细胞株的形态观察

倒置显微镜下Eca109细胞形态（图1），未克隆分选的Eca109细胞呈多种形态，大多数为短梭形，核圆，胞浆丰富，少数为圆形和多角形，核大浆少（图1a）；单个细胞克隆扩增法将圆形（图1b）和短梭形细胞（图1c）分离出来。HE染色Eca109细胞见图2。

2．2 免疫细胞化学检测

在Eca109单克隆细胞株中Oct－4均阳性表达，未克隆分选的Eca109细胞既有核表达也有浆表达（图3a），在圆细胞株定位于胞核，呈棕褐色（图3b），短梭形细胞株定位于胞浆，呈浅黄色，表达较弱（图3c）。

在Eca109单克隆细胞株中P75NTR均阳性表达，未克隆分选的Eca109细胞有核表达也有浆表达（图4a），圆细胞株中定位表达于胞核，呈棕褐色（图4b），短梭形细胞株定位表达于胞浆，呈浅黄色（图4c）。

2．3 Eca109单克隆细胞株的增殖情况

用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）分别检测未克隆细胞、克隆后圆细胞和短梭形细胞连续7d的增殖情况，检测数据采用SPSS17．0软件进行统计学处理，采用方差分析，结果见表1和图5。

由表1和图5可知：3组细胞株组间差异非常显著P＝0．000，F＝52．345。组间两两比较，圆细胞株和短梭细胞株组之间P＜0．05，未克隆细胞与短梭形细胞株组之间P＜0．05，7d之间细胞抑制率相比，差异均有统计学意义P＜0．05。

2．4 平板克隆形成实验

重复3次平板克隆，经染色计数后发现圆形细胞克隆率明显高于梭短细胞和未克隆细胞，且克隆团大而圆（图6）。

检测数据采用SPSS17．0软件进行统计学处理，采用方差分析，结果见表2。

由表2可知：3组细胞株组间克隆率差异非常显著P＝0．000，F＝68．253。组间两两比较，圆细胞株和短梭细胞株组之间P＜0．05，未克隆细胞组与短梭形细胞株组之间P＜0．05，圆形细胞株和未克隆细胞组之间P＜0．05，差异具有统计学意义。

2．5 细胞侵袭实验

Transwell体外侵袭实验，以48h穿过Matrigel基质胶到达滤膜的细胞数表示细胞侵袭能力的大小，结果显示3种细胞株的侵袭能力差异不大，没有统计学意义（图7）。

3 讨论

P75NTR是神经营养因子的低亲和力受体，属于肿瘤坏死因子受体超家族（TNGF）的成员之一，广泛分布于神经系统及众多非神经系统的组织及肿瘤细胞中。研究发现P75NTR参与调节多种系统肿瘤的发生以及恶性进展，并都有阳性表达。孙志刚等［4］应用P75NTR对人食管肿瘤细胞进行分选，发现P75NTR阳性细胞具有肿瘤干细胞的特性。Huang等［5］采用无血清培养法富集食管癌干细胞，P75NTR细胞的比例高达68．3%，与常规培养下的0．32%～3．25%相比，差异有显著性。

Oct－4是一种公认的干细胞表面标志物，它在干细胞中既能控制干细胞向特定细胞类型分化，又可以维持干细胞保持未分化状态并促进细胞不断增殖，近年发现在某些肿瘤组织中有表达，而且在口腔鳞状细胞癌肿瘤干细胞样细胞中高表达［6］。

前期本课题组许健等［3］发现，三氧化二砷诱导食管癌细胞后，存在P75NTR、Oct－4核阳性表达细胞增多的现象，这表明此类细胞具有很强的耐药性，推测有可能是食管癌干细胞。因此，本研究组将通过对人食管癌Eca109细胞进行单细胞克隆培养获得不同的细胞株，观察发现存在两种形态的细胞亚型，即小圆形和短梭形。通过免疫细胞化学对两种亚型的细胞进行P75NTR、Oct－4的表达定位观察，发现小圆细胞P75NTR、Oct－4均在细胞核表达，并且随着细胞传代次数的增加，其核阳性表达的细胞有所减少，形态也发生了变化，由圆形逐渐变为梭形，说明其具有分化产生其他表型的能力。MTT法和平板克隆实验检测小圆细胞，短梭细胞和未克隆分选的Eca109细胞的体外增殖能力，发现小圆细胞的增殖速度明显快于其他两组细胞（P＜0．001），但细胞侵袭能力却没有多大差异，这可能与细胞分化变性有关。

本实验结果表明，P75NTR、Oct－4核阳性表达的小圆形Eca109细胞符合假定的食管癌干细胞的特性，提示在此亚群细胞中可能有干细胞存在。但其他体内实验检测干细胞的特性如自我更新能力、致瘤能力还未进行，在以后的研究中我们将联合以上干细胞特性对P75NTR、Oct－4核阳性表达的小圆形Eca109细胞进行鉴定，这将为能否分离与鉴定出食管癌肿瘤干细胞和临床食管癌的治疗等相关性研究奠定良好的基础。

［1］孙燕．内科肿瘤学［M］．北京：人民卫生出版社，2001：102．

［2］Reya T，Morrison S J，Clarke M F，et al．Stem cells，cancer and cancer stem cells［J］．Nature JT－Nture，2001，414（6859）：105－111．

［3］许健．食管癌干细胞的分离与鉴定［D］．石河子：石河子大学，2011．

［4］孙志刚，黄盛东，张宝仁，等．应用p75NTR分选食管肿瘤干细胞并鉴定其生物学特性［J］．第二军医大学学报，2009，30（5）：481－486．

［5］Huang S D，Yuan Y，Liu X H，et al．Self－renewal and chemotherapy resistance of p75NTR positive cells in esophageal squamous cell carcinomas［J］．BMC Cancer，2009，9（9）：9－17．

［6］Chiou S H，Yu C C，Huang C Y，et al．Positive correlations of Oct－4and nanog in oral cancer stem －like cells and high grade oral squamous cell carcinoma［J］．Clil Cancer Res，2008，14（13）：4085－4095．