狂犬病病毒实验室检测方法研究进展

杨妍梅，冯若飞，马忠仁

（1.西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃兰州730030；2.甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州730030；3.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030）

狂犬病（Rabies）俗称疯狗病，又称恐水症，是由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）引起的一种人畜共患的急性接触性传染病，发病后病死率几乎为100%。我国是狂犬病的高发地区，感染狂犬病死亡人数居世界第二，仅次于印度。当今世界，狂犬病仍然是一种高发的人畜共患病，无论在发达国家［1］，还是发展中国家［2］，都是重点防控的传染病。狂犬病在我国曾一度得到有效控制，值得关注的是我国城乡养犬、猫等宠物的家庭迅速增加，野犬、猫的数量均呈现增多趋势［3］，使该病的发病率近年有上升趋势。

狂犬病病毒是弹状病科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属的成员，为不分节段的单股负链RNA病毒，基因组长度为11 928nt～11 932nt，编码5种结构蛋白，顺次为核蛋白（N）、磷酸蛋白（M1）、基质蛋白（M2）、糖蛋白（G）和 RNA聚合酶（L），分别由对应的5种结构基因编码，其中N基因具有毒株间相对保守和高拷贝复制的特点，成为病毒分型、系统发生分析和分子诊断的目标序列［4］。狂犬病实验室诊断方法主要包括酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）、荧光抗体技术（fluorescence antibody，FA）方法、快速荧光抑制灶技术（RFFIT）、反转录－聚合酶链反应（reverse transcription－polymerase chain reaction，RT－PCR）、荧光定量RT－PCR，环介导等温扩增技术（loop－mediated isothermal amplification，LAMP）和基因芯片（Genechip）等方法［5］。本文就这些方法在狂犬病病毒检测上的应用进行归纳和总结。

1 狂犬病病毒的分离

自从1881年巴斯德把人的狂犬病病毒经家兔传代而分离到固定毒以来，现世界各地都已分离到了狂犬病病毒。狂犬病病毒的分离方法可分为两种，一种是实验动物分离，先将含有狂犬病病毒的脑组织悬液在易感动物体内接种，再进行狂犬病病毒的分离，并对易感动物的脑组织采用免疫荧光技术检测［6］。另一种是易感细胞培养，培养24h～48h后，用免疫荧光检测狂犬病病毒包涵体，即Negri小体［7］。由于细胞培养有许多优点，可提高疫苗的质量及病毒的含量；可以结合免疫学技术和病毒学技术发展成各种快速、简便的测定狂犬病病毒的方法，这就使在实验室对狂犬病病毒的研究变得容易进行，所以它是病毒学上最常用的分离病毒的方法。

2 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（ELISA）检测在一般实验室即可进行，既可测抗原又可测抗体，快速简便，单流程数小时即可完成，适合做批量样品检测，价格低廉，是最适合大范围狂犬病病毒筛查的一种方法，但是该方法存在操作过程繁琐，与实验人员的熟练程度呈正相关的缺点。已有报道的ELISA检测法主要有竞争法、双抗夹心法、间接法等，成功的ELISA法检测的灵敏度和特异性都应在85%以上［8－9］。

Feyssaguet M 等［8］报 道 的 PLATELIATM RABIESⅡELISA试剂盒采用狂犬病病毒糖蛋白包被检测板，与RFFIT检测比较灵敏度为98.6%，特异度为99.4%，基本上可以替代RFFIT进行狂犬病病毒中和抗体检测。罗金燕等［10］将狂犬病病毒糖蛋白（G蛋白）中和抗原表位串联表达的重组蛋白作为抗原，建立了检测RABV中和抗体的间接ELISA技术。该方法与快速荧光灶抑制试验（RFFIT）的阳性符合率为88%，阴性符合率为96%，具有良好的特异性和重复性。宫苗苗等［11］以原核表达的狂犬病病毒M蛋白为检测抗原，建立了间接ELISA抗体检测方法，并利用该方法与商品化试剂盒同时检93份临床血清样品，结果二者的符合率为89.2%，由此可见，该方法比较灵敏。Kazuak等将常规的酶联免疫技术和微量技术相结合检测中和抗体，结果是快速荧光抑制灶技术（RFFIT）一致，并且比RFFIT快速易行。

3 荧光抗体技术

荧光抗体技术是以荧光物标记抗体进行抗原定位的技术，荧光抗体技术包括荧光抗体染色技术（FAT）和快速荧光抑制灶技术（RFFIT）。该技术在检测动物和人狂犬病病毒时快速且敏感，是狂犬病诊断的金标准。

3.1 荧光抗体方法

荧光抗体方法有直接和间接两种，它可检测病毒抗原，对病毒在细胞中进行定位。该方法既灵敏、特异性又高，应用价值非常高。该法可直接涂片检测，也能用于检测细胞培养或被接种小鼠的脑组织中狂犬病病毒抗原是否存在［12］。对于新鲜病料，FA法可以快速得出结果，准确率可达95%～99%。FA法与其他任何检测方法相同，其可靠性主要影响因素有狂犬病病毒、样品性质和实验人员的熟练程度［13］。其特异性和灵敏度，一定程度上依赖于亲和力、梯度及特异性结合狂犬病病毒核蛋白的最佳荧光抗体。Sylvia Z［14］检测了800多份来自14种不同动物的怀疑有狂犬病病毒的脑组织，用新鲜病料同时用福尔马林固定，荧光抗体方法检测两种病料的阳性结果符合率达99.8%，未出现假阳性，对两种病料的特异性均达100%。因此得出结论，用FA方法检测狂犬病病毒抗原，用新鲜病料或用经福尔马林固定后的病料，效果是等同的。

3.2 中和抗体效价快速荧光灶抑制试验

中和抗体效价快速荧光灶抑制技术（RFFIT）是世 界 卫 生 组 织 （（World Health Organization，WHO）推荐的检测狂犬病病毒中和抗体的标准试验方法［15］，主要应用于狂犬病疫苗的免疫学效果评估［16－17］和狂犬病病毒中和抗体替代检测试剂和方法的评估［18－19］，是狂犬病疫苗及中和抗体诊断试剂评价的关键技术。

1979年，Englene等把RFFIT和微量技术结合起来测定中和抗体，与MNT比较，结果一致，并推荐为测定中和抗体的标准方法。对RFFIT的改进的研究一直在进行，法国Pharpr D等［20］在RFFIT结果的自动化判读方面获得成功，日本Khawplod P等［21］应用表达绿色荧光蛋白的rHEP－GFP重组狂犬病病毒作为攻击病毒进行RFFIT，可以直接观察结果。吕新军等［22］研究表明，RFFIT检测体系稳定性良好，可用于其他样品检测。完善了体系灵敏度、特异性、稳定性、重复性等主要指标的评价，同时说明他们采用与荧光显微镜配套的电脑成像系统进行结果观察，为RFFIT结果的观察提供方便。吴小红等［23］采用RFFIT和小鼠中和试验检测我国抗狂犬病免疫球蛋白国家标准品的GMT，结果两种方法的检测结果之间呈正相关。

常用的血清学技术除中和试验外，还有补体结合试验、间接荧光抗体试验、交叉保护试验、血凝抑制试验以及间接免疫酶试验等等。近年来单克隆抗体技术也可用于狂犬病的诊断。

4 反转录－聚合酶链反应

反转录－聚合酶链反应（RT－PCR）是荧光抗体方法的补充，检测结果较直观，易于判定，获得的序列能够直接用毒株的系统发生分析，但是，RT－PCR检测狂犬病病毒缺乏规范性程序，许多实验室出现污染或假阴性问题［24］。但由于RT－PCR能够对高通量样品的实现快速检测，因此该方法还是得到了广泛的运用。江禹等［25］建立了能够有效扩增7种基因型RV基因组片段的套式RT－PCR（nested RTPCR）方法。该方法能够检测到4.6个TCID50的SRV9固定毒。对街毒脑组织样品检测的灵敏度较乳鼠脑内接种试验（MIT）高出100倍，对3种鼠脑固定毒、12种犬脑街毒样品的检测结果与FAT检测结果一致。Aravindh Babu R P等［26］利用3种不同引物组合评价RT－PCR快速检测狂犬病不同动物脑组织的的敏感性和特异性，其检测结果与FAT检测结果100%相符。Wacharapluesadee S等［27］利用RT－PCR方法从保存达16年的狂犬病人脑样品中检测出狂犬病病毒N基因的150bp目的条带，但用免疫组化反应中阳性率较低。Whitby J E等［28］将RT－PCR和PCR－ELISA相结合，可区分经典的狂犬病病毒和欧洲蝙蝠狂犬病病毒，结果显示，该法比Southern blot敏感100倍，具有快速、敏感和简便等优点。

5 荧光定量PCR检测

荧光定量PCR检测方法是一种敏感、快速、重复性好的高通量检测手段。国内外应用这一技术已经建立了多种检测RABV的荧光定量PCR方法。该技术自1991年首次用于RABV的实验室诊断以来，已成为 WHO和世界动物卫生组织（Office International Des Epizooties，OIE）推荐的标准方法［29］，但是该方法易出现假阳性，这有待深入研究。

针对我国狂犬病的流行特点，许运斌等［30］针对RABV N基因保守序列设计并合成了一套简并引物和TaqMan探针，在优化反应条件的基础上，建立了检测RABV核酸的一步法荧光定量RT－PCR（qRT－PCR）检测方法，他们建立的qRT－PCR与套式RT－PCR的符合率为100%。检测29份新鲜和5份腐败的临床犬脑组织样品，qRT－PCR与套式RTPCR均检测出12份阳性的新鲜样品和5份阳性的腐败样品。高志强等［29］建立了古典狂犬病病毒荧光RT－PCR检测技术，并应用该技术对宠物医院提供的犬唾液样品进行了检测，结果显示荧光RTPCR试验结果同病毒分离检测结果均为阴性，没有发现阳性样本，但从采集的流浪犬唾液样品中检出了阳性样本。Crepin P等研究表明，采用常规的RT－PCR方法可从唾液样品或CSF样品中检出狂犬病病毒核酸，而且有时与死后确诊结果符合率达100%［31－32］。Wakeley P R 等［33］建立了 TaqMan实时荧光RT－PCR用于检测狂犬病病毒，结果其灵敏度高于常规的RT－PCR方法，与套式RT－PCR灵敏度相同［29］。结合TaqMan基因型特异探针的RTPCR的方法能快速有效鉴别病毒。实时荧光定量RT－PCR检测唾液样品比传统RT－PER的灵敏度高。Hughes J G等［34］设计一个检测组织样品狂犬病病毒RNA的TaqMan PCR方法，并证明该方法敏感性、特异性均较高。Supaporn W 等［35］利用TaqMan实时定量RT－PCR对非神经样本进行狂犬病病毒RNA检测的特异性为100%。

6 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术（LAMP）是2000年由Notomi T等［36］首先报道的一种新颖的核酸扩增技术，即核酸环介导等温扩增技术。LAMP技术采用能特异识别靶序列上6个位点的4条引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件（60℃～65℃）下，1h内其扩增效率可达到109～1010个数量级，具有特异性强、等温灵敏、操作简单、结果易判定等优点，但是其有易污染的致命的缺点。

许丹等［37］检测17份临床样本的结果显示，LAMP法和传统PCR法的敏感性一致，阳性检出率均为23.5%。该法操作简单，整个试验过程比普通PCR法节省时间1.5h。黄元等［38］针对狂犬病病毒的核衣壳蛋白基因（N基因）和大转录酶蛋白基因（L基因）中的高度保守区段分别设计了一套引物，建立了检测狂犬病病毒的快速一步式反转录－环介导恒温扩增（RT－LAMP）方法。RT－LAMP具有良好的特异性，灵敏度比RT－套式PCR高10倍以上。该方法灵敏、快速 、简便，在基层比较适用。已有报道Saitou Y 等［39］和 Hayman D T 等［40］通过使用 RTLAMP法来检测狂犬病病毒。

7 基因芯片技术

基因芯片（又称DNA芯片、生物芯片）是在20世纪80年代中期提出的。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。基因芯片具有新型化、高通量、高度平行性和高速性的特点，已经广泛应用于发现与疾病相关的新基因、基因表达谱分析、药物的研究与开发等诸多方面［41－42］。张伟等［43］在探针反相杂交技术的基础上，融合基因芯片的基本原理、核酸分子碱基互补配对的原则和酶联显色技术的基本原理建立了RABV低密度基因芯片。检测160份可疑犬的血的结果表明该方法比ELISA和 RT－PCR灵敏度高、特异性强［44］。王振全等［45］在靶基因的上游引物5′端标记了生物素Biotin，提高了杂交特异性和灵敏度。诊断基因芯片由于在每份检测样品中都设置阳性和阴性参照，并通过分子杂交进行确认，有效地克服了PCR易被污染的缺点。利用计算机分析软件进行分析、确诊，大大降低了在结果判断过程中的主观因素，使各个实验室得到的结果具有可比性，而且诊断基因芯片检测样本量越大，成本越低；不仅快速、准确、敏感，而且可以同时进行多种病毒的检测，有利于大规模推广应用。

8 总结

狂犬病是危害人类生命的重大疫病之一，急需一种快速、准确的诊断方法，同时，国际上也亟待一套规范化的诊断程序。血清学方法是狂犬病病毒实验室诊断的主要方法，快速、简便、低成本并以重组蛋白作为诊断抗原的血清学方法是现阶段的发展趋势。ELISA方法较为常用，适用于医院内大批量血液的筛查，也可用于确诊。PCR方法作为血清学方法的有效补充，但引物的特异性和灵敏度仍待提高。RFFIT技术快速、精确和重复性好。LAMP检测方法的优点和血清学方法的优点相似，但是其易污染。荧光定量PCR检测是一种快速、灵敏、高特异性、污染率低以及可广泛应用于我国狂犬病病毒检测的方法。基因芯片技术有效地克服了PCR易被污染的缺点，具有高的灵敏度、特异性和可靠性。未来的发展趋势是在这些诊断方法中筛选出简单、快速、准确并且成本低、易推广的诊断技术。

［1］ Blanton J D，Palmer D，Dyer J，et al.Rabies surveillance in the United States during［J］.J Am Vet Med Asso，2011，239：773－783.

［2］ Gongal G，Wright A E.Human rabies in the WHO Southeast Asia Region：forward steps for elimination［J］.Adv Prev Med，doi：10.4061／2011／383870.

［3］ 王 科，叶 峰，赵英仁.狂犬病的研究进展［J］.临床内科杂志，2010，5（27）：298－301.

［4］ Bourhy H，Tordo N，Kissi B.Molecular diversity of the Lyssavirus genus［J］.Virology，1993，194：70－91.

［5］ Smith J S，King A A.Laboratory techniques in rabies，Fourth edition［M］.Geneva：WHO，1996.

［6］ 俞永新.狂犬病和狂犬病疫苗［M］.北京：中国医药科学技术出版社，2001：71－109.

［7］ Zaidman G W，Billingsley A.Corneal impression test for the diagnosis of acute rabies encephalitis［J］.Ophthalmology，1998，105（2）：249－251.

［8］ Feyssaguet M，Dacheux L，Audry L，et al.Multicenter comparative study of a new ELISA，PLATELIATM RABIES II，for the detection and titration of anti－rabies glycoprotein antibodies and comparison with the rapid fluorescent focus inhibition test on human samples from vaccinated and non－vaccinated people［J］.Vaccine，2007，20（25）：2244－2251

［9］ Cliquet F，McElhinney L M.Development of a qualitative indirect ELISA for the measurement of rabies virus specific antibodies from vaccinated dogs and cats［J］.J Virol Meth，2004，9（117）：1－8.

［10］ 罗金燕，王水明，李向东，等.狂犬病病毒中和抗体ELISA技术的建立［J］.中国动物检疫，2011，28（1）：48－51.

［11］ 宫苗苗，曾 妮，程朝飞，等.狂犬病病毒 基质蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立 ［J］.中国人畜共患病学报，2013，29（1）：17－26.

［12］ Rudd R J，Smith J S，Yager P A，et al.A need for standardized rabies－virus diagnostic procedures：Effect of cover－glass mountant on the reliability of antigen detection by the fluorescent antibody test［J］.Virus Res，2005，111（1）：83－88.

［13］ 殷 震，刘景华.动物病毒学［M］.2版.北京：科学出版社，1997：779－795.

［14］ Woldehiwet Z.Clinical laboratory advances in the detection of rabies virus［J］.Clin Chim Acta，2005，351（1－2）：49－63.

［15］ World Health Organization·WHO expert consultation on rabies，2004，First Report；WHO technical report series＃931.World Health Organization［M］.Geneva：Switzerland，2005.

［16］ Shanbag P，Shah N，Kulkarni M，et al.Protecting Indian school children against rabies：pre－exposure vaccination with purified chick embryo cell vaccine（PCECV）or purified verocell rabies vaccine（PVRV）［J］.Hum Vaccine，2008，4（5）：65－369.

［17］ Manickama R，Basheer M D，Jayakumar R，et al.Postexposure prophylaxis（PEP）of rabies－infected Indian street dog［J］.Vaccine，2008，26（51）：6564－6568.

［18］ Shiota S，Mannen K，Matsumoto T，et al.Developmentand evaluation of a rapid neutralizing antibody test for rabies［J］.J Virol Meth，2009，161（1）：58－62.

［19］ Welch R J，Anderson B L，Litwin C M.An evaluation of two commercially available ELISAs and one in－house reference laboratory ELISA for the determination of human anti－rabies virus antibodies［J］.J Med Microbiol，2009，58（6）：806－810.

［20］ PéharpréD，Cliquet F，SagnéE，et al.Comparison of visual microscopic and computer－automated fluorescence detection of rabies virus neutralizing antibodies［J］.J Vet Diagn Invest，1999，11（4）：330－333.

［21］ Khawplod P，Inoue K，Shoji Y，et al.A novel rapid fluorescent focus inhibition test for rabies virus using a recombineant rabies virus visualizing agreen fluorescent protein［J］.J Virol Meth，2005，125（1）：35－40.

［22］ 吕新军，唐 青，Bourhy H，等.狂犬病病毒中和抗体检测快速荧光灶抑制试验的建立［J］.中国卫生检验杂志，2010，20（2）：439－441.

［23］ 吴小红，李 加，唐建蓉，等.抗狂犬病病毒中和抗体效价快速荧光灶抑制试验（RFFIT）的建立及应用［J］.中国生物制品学杂志，2009，22（11）：1145－1148.

［24］ Hoffmann B，Freuling C M，Wakeley P R，et al.Improved safety for molecular diagnosis of classicalnrabies viruses by use of a TaqMan real－time reverse transcription－PCR “double check”strategy［J］.J Clin Microbiol，2010，48：3970－3978.

［25］ 江 禹，王莉莉，韩小虎，等.动物狂犬病病毒巢式RT－PCR检测方法的建立［J］.中国预防兽医学报，2009，29（8）：1003－1007.

［26］ Aravindh Babu R P，Manoharan S，Ramadass P，et al.Evaluation of RT－PCR assay for routine laboratory diagnosis of rabies in post mortem brain samples from different species of animals［J］.Indian J Virol，2012，23（3）：392－396

［27］ Wacharapluesadee S，Ruangvejvorachai P，Hemachudha T.A simple method for detection of rabies viral sequences in 16－year old archival brain specimens with one－week fixation in formalin［J］.J Virol Meth，2006，134（1－2）：267－271.

［28］ Whitby J E，Heaton P R，Whitby H E，et al.Rapid detection of rabies and rabies－related viruses by RT－PCR and enzymelinked immunosorbent assay［J］.J Virol Meth，1997，69（1－2）：63－72.

［29］ 高志强，张鹤晓，柏亚铎，等.狂犬病病毒快速荧光RT－PCR检测方法研究与应用［J］.中国兽医杂志，2010，46（1）：14－17.

［30］ 许运斌，邵明富，范金红，等.基因1型狂犬病病毒一步法荧光定量RT－PCR检测方法的建立［J］.中国人兽共患病学报，2011，27（4）：297－310.

［31］ Heaton P R，Johnstone P，MacElhinney L M，et al.Hemi－nested PCR assay for the detection of six genotypes of rabies and rabies－related viruses［J］.J Clin Microbiol，1997，35：2763－2766.

［32］ Fekadu M，Shaddock J H，Baer G M.Excretion of rabies virus in the saliva of dogs［J］.J Infect Dis，1982，145：715－719.

［33］ Wakeley P R，Johnson N，McElhinney L M，et al.Development of a real－time，TaqMan reverse transcription－PCR assay for detection an differentiation of Lyssavirus genotypes 1，5，6［J］.J Clin Microbiol，2005，43：2786－2792.

［34］ Hughes G J，Smith J S，Hanlon C A，et al.Evaluation of a TaqMan PCR assay to detect rabies virus RNA：Influence of sequence variation and application to quantification of viral loads［J］.Clin Microbiol，2004，42：299－306.

［35］ Supaporn W，Veera T，Pornpun S，et al.Detection of rabies viral RNA by TaqMan real－time RT－PCR using non－neural specimens from dogs infected with rabies virus［J］.J Virol Meth，2012，184：109－112.

［36］ Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop－mediated isothermal amplification of DNA ［J］.Nucleic Acids Res，2000，28（12）：63.

［37］ 许 丹，杨松涛，冯 娜，等.狂犬病病毒LAMP检测方法的建立及初步应用［J］.中国预防兽医学报，2010，11（30）：1476－1479.

［38］ 黄 元，向 华，陈 晶，等.狂犬病病毒核酸RT－LAMP检测方法的建立［C］／／2010年全国狂犬病防控高层论坛，2010：207－212.

［39］ Saitou Y，Kobayashi Y，Hirano S，et al.A method for simultaneous detection and identification of Brazilian dog－and vampire bat－related rabies virus by reverse transcription loop－mediated isothermal amplification assay［J］.J Virol Meth，2010，168：13－17.

［40］ Hayman D T，Johnson N，Horton D L，et al.Evolutionary history of rabies in Ghana［J］.Plos Negl Trop Dis，2011，5（4）：e1001.

［41］ Ranz J M，Machado C A.Uncovering evolutionary patterns of gene expression using microarrays ［J］.Trends Ecol Evol，2006，21（1）：29－37.

［42］ Goldschmidt M C.The use of biosensor and microarray techniques in the rapid detection and identification of salmonellae［J］.J AOAC Int，2006，89（2）：530－753.

［43］ 张 伟，吴时友，尹燕博，等.狂犬病病毒低密度基因芯片的建立及其与常规检测方法的比较研究［J］.江苏农业科学，2007（2）：139－141.

［44］ Southern E，Mir K，Shchepinov M.Molecular interactions on microarrays［J］.Nature Genet，1999，21（1）：5－9.

［45］ 王振全，罗宝正，薄清如，等.基因芯片方法检测6种动物源性人兽共患病病原［J］.中国预防兽医学报，2011，33（10）：804－807.