布鲁菌二元调控系统研究进展

董 浩，吴清民

（中国农业大学动物医学院 农业部动物流行病和人畜共患病重点实验室，北京100193）

二元调控系统是一种可以对环境信号进行感应、传递并做出相应适应的调控机制。典型的二元调控系统通常是由与细胞膜结合的组氨酸激酶（histidine kinases，HK）和含有天冬氨酸残基的反应蛋白（response regulator，RR）组成，通过磷酸化的方式完成信号的传递。该信号传递过程由3个依次进行的3个酶促磷酰基团转移反应组成：①组氨酸激酶与三磷酸腺苷（ATP）中的磷酰基团结合，使组氨酸激酶磷酸化（自磷酸化）；②组氨酸激酶将磷酰基团传递给反应蛋白的天冬氨酸残基，使反应蛋白构象发生改变（转移磷酸化）；③磷酸化的反应蛋白与水反应失去磷酰基团（去磷酸化）。在真核生物中，只有酵母和拟南芥中发现过少量二元调控系统，而在原核生物的基因组中平均有约1%的基因编码不同的二元调控系统。在细菌中，二元调控系统不仅参与感应pH、养分、渗透压、抗生素、氧化还原状态等环境信号，还控制着对细菌生长、毒力、生物膜、趋化性、趋光性和群体感应等有重要作用的基因簇［1］。对细菌二元调控系统的研究，在揭示细菌与周围环境之间的相互作用、细菌的调控网络以及病原菌的致病机制与防治等多个方面都有重要意义。本文综述了布鲁菌二元调控系统的研究现状及二元调控系统在布鲁菌病防控中的应用。

1 布鲁菌的二元调控系统

布鲁菌是一种革兰阴性的胞内寄生菌。由布鲁菌感染引起的布鲁菌病（布病）是一种严重的人兽共患病，给养殖业、人类健康和动物源性食品安全带来很大的威胁。布病在世界各地都广泛流行，据报道有123个国家和地区发生过该病，主要分布在亚洲、非洲和中南美洲。目前世界上除了少数几个发达国家宣布根除了布鲁菌病外，大多数国家都存在该病［2］，每年全世界因布病造成的经济损失高达数亿美元。

与其他的病原菌相比，布鲁菌不具有经典的毒力因子。其致病机制主要是布鲁菌具有在各种宿主细胞，如吞噬细胞内极强的生存和增殖能力。布鲁菌被吞噬细胞吞噬后，需要应对酸性pH、缺氧、活性氧介质（reactive oxygen species，ROS）、活性氮介质（reactive nitrogen species，RNS）、营养匮乏等多种不利环境［3］。迅速地感应相应的环境信号并且做出反应对于布鲁菌在巨噬细胞内的生存是至关重要的。布鲁菌基因组测序结果发现在布鲁菌中存在21个基因假定编码的二元调控系统［4］，目前在布鲁菌中研究比较清楚的二元调控系统共有7组。

1.1 BvrR／BvrS二元调控系统

Sola－Landa A等［5］通过转座子突变技术筛选到毒力降低的bvrR和bvrS 2个基因的突变株，且这2个突变株对聚合阳离子和表面活性剂敏感性增强。通过同源性比对发现BvrR／BvrS与根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）的 ChvI／ChvG 及 苜蓿根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）的ChvI－ExoS二元调控系统具有极高的同源性（87%～89%和70%～80%）。在牛布鲁菌中，bvrR和bvrS基因缺失后在小鼠体内的毒力显著降低，在HeLa细胞和鼠源巨噬细胞内的侵入能力也是显著降低，且无法在胞内繁殖。

BvrR／BvrS缺失株中外膜蛋白 Omp25和Omp22在转录和翻译水平上均显著降低［6］，并且类脂A的酰基化程度和疏水性都发生了改变［7］。然而，在Omp22缺失株和Omp25缺失株中天然半抗原多糖成分，LPS和外膜蛋白的表达水平，对于补体杀伤和多黏菌素B的敏感性，以及在细胞模型和动物模型中的生存能力均与野生菌株无显著差异［8］，说明外膜蛋白表达水平的差异并不是BvrR／BvrS二元调控系统被破坏后毒力降低的主要原因。

随着转录组学和蛋白组学的发展，极大地推动了基因功能方面的研究。Viadas C等［9］通过基因芯片的方法对bvrR缺失株进行转录组分析时发现，与野生株相比bvrR缺失株有127个基因差异表达（83个基因表达上调，44个基因表达下调）；编码磷酸转移酶操纵子和麦芽糖转运系统的操纵子表达水平下调；多个与细菌外膜成分，应激反应，代谢相关基因以及转录调控因子差异表达。Martinez－Nunez C等［10］发现BvrR蛋白可以直接结合到virB操纵子的启动子序列上，且影响着群体感应系统vjbR基因的表达。这些研究充分阐明了BvrR／BvrS二元调控系统与细菌毒力之间的关联。值得注意的是这种二元调控系统调节细菌分泌系统表达的机制在根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）、巴尔通体（Bartonella henselae）等其他α－变形菌中普遍存在，说明这种保守的调节模式在这些细菌与宿主相互作用过程中发挥着重要的作用［10］。

1.2 OtpR二元调控系统

羊种布鲁菌的otpR基因的编码产物具有二元调控系统的高度保守的结构域，它与下游基因cpk（cAMP依赖的蛋白激酶调控亚单位）共同构成了一个操纵子。OtpR与新月柄杆菌（Caulobacter crescentus）中的CenR蛋白有较高的同源性（indentity：65%，similarity：79%）。otpR基因是通过转座子突变技术筛选布鲁菌毒力相关基因时发现其突变株在细胞和小鼠模型中均致弱［11］。进一步研究表明，otpR缺失株在高温、高渗和低pH环境中生存能力显著降低［12］，除此之外otpR基因还对维持细菌的正常细胞形态以及耐受β－内酰胺类抗生素起到关键作用［13］。然而，OtpR作为一个调节蛋白不具有接受信号分子的功能区，其对应的感应蛋白目前仍是未知的。

1.3 LOV－组氨酸激酶

LOV功能区在新月柄杆菌（Caulobacter cres－centus）、枯草芽胞杆菌（Bacillis subtilis）和丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）等细菌中与光信号的感应相关。在布鲁菌基因组中，有一个含有LOV功能区的组氨酸激酶（LOV－HK），光照可以增强这个激酶的活性，这说明这个激酶很可能与细菌感应光信号密切相关。Swartz T E等发现布鲁菌在黑暗环境中培养时，其在细胞模型和小鼠模型中的毒力低于见光培养的布鲁菌。而当牛种布鲁菌中编码LOV－组氨酸激酶的基因缺失后，无论缺失株在光照还是黑暗环境下培养，其在J774A.1巨噬细胞中生存和增殖能力均显著降低，且和黑暗中培养布鲁菌的毒力类似。这充分阐明了LOV组氨酸激酶在介导光照与布鲁菌毒力的关联中发挥着重要的作用。由于布鲁菌的生活史与其宿主紧密联系，所以布鲁菌是何时感应光信号就难以解释。一种可能是当布鲁菌随着被感染的胎盘一起排出体外时，暴露在光源下，LOV－组氨酸激酶调节相应基因的表达以准备对新宿主的感染［14］。

1.4 NtrY／NtrX二元调控系统

NtrY／NtrX二元调控系统在α－变形菌中广泛存在，ntrY基因的同在田菁茎瘤固氮根瘤菌（Azorhizobium caulinodans）、巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）及荚膜红细菌（Rhodobacter capsulatus）中与细菌的氮代谢以及生物固氮相关［15－17］。Foulongne V等［19］通过转座子突变了猪布鲁菌的ntrY基因，发现该基因的突变株在人类巨噬细胞中无法生存［18］。Carrica M C等发现NtrY蛋白是以血红素为辅因子，可与NO和CO形成复合物，且在存在氧气的情况下极易被氧化为三价铁的稳定状态，由此解释了NtrY组氨酸激酶感应环境中氧化水平的机制。细菌双杂交技术验证了在布鲁菌中NtrY与其下游的NtrX相互作用，即NtrY／NtrX二元调控系统在布鲁菌中也是保守的。进一步的研究表明，ntrY基因缺失后在正常条件下和微氧条件下都影响了反硝化途径中4个操纵子的表达水平，这说明NtrY／X二元调控系统很可能与布鲁菌在微氧条件下生存是相关的。

1.5 FeuP／FeuQ二元调控系统

FeuP／FeuQ是布鲁菌中第一个被发现的二元调控系统，它与豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum）中调控铁摄取的二元调控系统FeuP／FeuQ同源性高达96%。猪布鲁菌的feuP基因缺失后在动物模型和细胞模型中均不致弱，而且在缺铁环境中的生存能力和野生株也没有显著差异［20］。然而Lestrate P等［21］却发现在羊布鲁菌中feuQ突变株在动物模型和细胞模型中均致弱，这种差异很可能是由于细菌生物型的不同而引起的。

1.6 NtrB／NtrC二元调控系统

Dorrell N等［22］通过同源性比对发现在布鲁菌存在一个与NtrC转录调控因子家族同源性高达90%的基因。NtrC与感应蛋白NtrB组成一个二元调控系统NtrB／NtrC。在其他多种细菌中，NtrB／NtrC二元调控系统与细菌的氮代谢以及毒力相关。猪种布鲁菌的ntrC基因缺失株在不同温度条件下生长速度没有差别，然而当存在多种氨基酸时，缺失株的代谢活性降低。与亲本菌株相比，ntrC基因缺失株在巨噬细胞内的生存和增殖能力没有差别，但是在小鼠感染过程中ntrC基因缺失株在小鼠脾脏内增殖的速度要低于亲本菌株。

1.7 PrlS／PrlR二元调控系统

PrlS／PrlR二元调控系统是由含有N端钠离子／溶质共转运功能区的组氨酸激酶（PrlS）和属于LuxR家族的转录调控因子（PrlR）组成。在体外环境中，PrlS／PrlR二元调控系统缺失的菌株无法在高渗环境中出现凝集现象。进一步的试验表明这个二元调控系统感应的信号与离子强度相关，而且PrlS／PrlR二元调控系统的缺失株在小鼠模型中生存能力显著降低［23］。

2 二元调控系统在布鲁菌病防控中的应用

由于编码组氨酸激酶（HK）和反应蛋白（RR）的基因只存在于原核生物以及少数低等真核生物的基因组中，这使得病原菌的二元调控系统成为一个理想的抗菌药物靶点。此外，和传统的抗菌药物不同，二元调控系统抑制物阻断了二元调控系统对毒力因子的调控从而降低病原菌的毒力，而并非杀死病原菌，极大地降低了细菌耐药性的产生［24］。目前，在致病性大肠埃希菌，结核分支杆菌及根癌农杆菌等细菌中已经鉴定出多种二元调控系统的抑制物［25－26］。尽管现在尚无布鲁菌二元调控系统抑制物方面的报道，但是这种方法可以很好的解决传统布病治疗过程中长期服用抗生素易产生耐药性的缺陷，因此在治疗人布鲁菌病方面具有广阔的应用前景。

目前，虽然已有S19、RB51和Rev.1等多个布鲁菌疫苗株，但其安全性和免疫保护力仍无法令人满意，因此寻找更安全更有效布鲁菌疫苗的研究从未停止。鉴于bvrR／bvrS缺失株具有毒力弱，光滑型LPS表型，且在常规细菌培养基中生长良好等特性，人们尝试着使用bvrR／bvrS缺失株去开发新型布鲁菌病疫苗。用bvrR／bvrS缺失株免疫小鼠后用牛种布鲁菌2308攻毒，所产生的免疫保护力与S19一致，并且效果优于RB51。更重要的是在bvrR／bvrS缺失株中不产生Omp3b蛋白，可以用于血清学鉴别。由于基因缺失疫苗菌株需要在宿主体内存活足够长的时间才能建立起持久有效的免疫力，在这方面bvrR／bvrS缺失株还是存在不足。将bvrS缺失株与粗糙型wbkA缺失株共同接种Balb／c小鼠可以显著地延长细菌在小鼠体内的存在时间，而且在使用牛种布鲁菌攻毒时能产生比S19更好的免疫保护力［27］。除了bvrR／bvrS缺失株，研究者们也尝试使用otpR缺失株开发新型布鲁菌疫苗，然而和bvrR／bvrS缺失株类似，由于otpR缺失株在动物模型中很快即被清除，因此无法建立起有效的免疫保护力（资料未发表）。

3 展望

目前，布鲁菌中还有多个二元调控系统未被研究过，鉴于布鲁菌的二元调控系统对于细菌抵御宿主的各种防御机制至关重要，布鲁菌二元调控系统的深入研究对于揭示布鲁菌的致病机制将起到重要的作用。除此之外，由于人类细胞主要采用丝氨酸／苏氨酸和酪氨酸激酶系统调节蛋白活性，在哺乳动物细胞中也不存在组氨酸激酶，这使得通过阻断布鲁菌的二元调控系统实现控制布鲁菌感染成为一种理论上安全且有效的方法。因此，寻找布鲁菌二元调控系统的抑制物无疑对抗布鲁菌感染具有重大的意义。

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