猪繁殖与呼吸综合征病毒检测技术研究进展

官家明，施开创，陈汉忠，莫胜兰

（1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁530005；2.广西动物疫病预防控制中心，广西南宁530001）

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），又称“猪蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起猪的一种急性、高度接触性传染病，临床上主要表现为妊娠母猪晚期流产，早产，产死胎、木乃伊胎等繁殖障碍和各种年龄猪特别是仔猪的严重呼吸道疾病。PRRS于1987年最早发生在美国，1991年荷兰报道了该病，此后相继在各主要养猪国家发生，现已呈世界性分布，给养猪业造成严重危害。PRRSV属于动脉炎病毒科、动脉炎病毒属，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组约为15kb。根据病毒基因组的差异，PRRSV可分为欧洲型和美洲型毒株，两种基因型毒株之间基因组差异很大，同源性仅为60%左右。我国于1996年首次分离到PRRSV美洲型经典毒株，2006年分离到PRRSV美洲型高致病性变异毒株（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP－PRRSV），2010年报道了致病性PRRSV欧洲型毒株在我国猪群的存在和流行。当前，HP－PRRSV仍然是我国的流行优势毒株，并且病毒基因组处于持续变异之中，严重威胁我国养猪业的健康发展。及时、准确地诊断该病，是采取有针对性的防控措施的基础。本文就PRRSV主要检测技术及其近年来的研究进展进行综述。

1 病毒的分离与鉴定

病毒分离是检测PRRSV最准确的一种方法。目前用于PRRSV增殖的细胞主要有原代猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophage，PAM）及来源于非洲绿猴肾细胞系的 MA－104细胞、CL2621细胞、Marc－145细胞及克隆自 Marc－145细胞的更敏感的HS.2H细胞。有报道，猴源SJPL细胞系非常适合于PRRSV复制，其产生的病毒滴度与Marc－145细胞相当，可用于PRRSV的分离与研究［1］。通常选取肺脏、淋巴结、扁桃体、脾脏和血清等病料用于分离PRRSV。将组织匀浆上清或血清接种敏感细胞后，观察是否出现特征性的细胞病变（cytopathic effect，CPE），主要表现细胞聚集、圆缩、固缩、脱落。研究发现，不同的病毒株适合生长在不同的细胞上，有的毒株仅生长在一种细胞上，有的则生长在多种细胞上，但大多数毒株特别是欧洲型毒株均适应PAM，因此在分离欧洲型毒株时应尽量采用PAM。不同分离株在敏感细胞培养物上增值情况不同，有些毒株在病料接种后第一代细胞培养即出现CPE，有些毒株则需在第3代才出现CPE，而有些毒株则不出现CPE，需结合其他检测技术如间接免疫荧光抗体试验（indirect immunofluorescent antibody test，IFA）、免疫过氧化物酶单层试验（immunoperoxidase monolayer assay，IPMA）、反转录－聚合酶链反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT－PCR）等方法进行验证。HP－PRRSV分离株容易在Marc－145细胞上增殖，产生典型 CPE［2］。

2 病毒抗原的检测方法

2.1 病毒中和试验

中和试验（serum neutralization test，SN）既可用于检测病毒抗原，也可用于检测病毒抗体。检测PRRSV的病毒中和试验于1992年首次建立并用于鉴定世界上首个PRRSV美洲型分离株（ATCC VR－2332株）。目前，病毒中和试验主要用于对PRRSV分离毒株的鉴定，更多时候则用来测定PRRSV 抗体［3］。

2.2 免疫过氧化物酶单层试验

检测PRRSV的免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）于1991年首次建立并用于鉴定世界上首个PRRSV欧洲型分离株（Lelystad virus，LV）。目前，IPMA是欧洲国家常用于PRRSV分离鉴定的方法。IPMA除可用于检测病毒抗原，还可用于检测病毒抗体［4］，是最早建立的PRRSV抗体检测方法。

2.3 间接免疫荧光抗体试验

Benfield D A等［5］利用针对PRRSV核衣壳蛋白的单克隆抗体（monoclonal antibody，MAb）和异硫氰酸荧光素（fluorecein isothiocyante，FITC），建立了检测PRRSV的免疫荧光抗体试验（immunofluorescent antibody test，FA）和 IFA，用 于PRRSV分离株的鉴定及感染组织、细胞中PRRSV抗原的检测。该法至今仍为美国及其他国家广泛采用。陈仕龙等［6］利用针对GP5蛋白的MAb建立了IFA，并与商品化RT－PCR鉴别试剂盒进行了比较，表明IFA与RT－PCR检测结果的符合率为100%。袁婧等［7］以HP－PRRSV分离株接种试验猪制备抗血清，经硫酸铵盐析法提取IgG后用FITC进行标记，建立了FA，用于检测病毒感染单层细胞及动物组织切片中PRRSV抗原，与RT－PCR检测结果的符合率达到96.3%。FA和IFA为PRRSV提供了一种快速、便捷、敏感、特异的检测方法。

2.4 免疫组织化学技术

免疫组织化学技术（immunohistochemistry，IHC）常被用于PRRSV感染组织和细胞的病原检测、抗原定位及甲醛固定样本的回顾性检测［8］。近年来，杨鸿等［9］采用免疫组织化学Envision二步法对疑似PRRS病猪肺组织的病毒抗原进行定量、半定量检测，证实该法可原位检测病猪肺组织PRRSV抗原的分布。

2.5 酶联免疫吸附试验

酶 联 免 疫 吸 附 试 验 （enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）是目前应用最广、发展最快的免疫检测技术，被广泛用于检测PRRSV抗体，而用于检测PRRSV抗原则鲜有报道。翁善钢等［10］以 兔 抗PRRSV 多 抗 作 为 捕获 抗 体、猪 抗PRRSV多抗作为检测抗体，建立了检测PRRSV的双抗体夹心ELISA，应用于临床组织病料中PRRSV 的 检 测。梁 海 霞 等［11］针 对 HP－PRRSV Nsp2基因序列设计引物，建立了核酸序列依赖性扩增 （nucleic acid sequence based amplification，NASBA）方法，并结合微孔板中液相杂交和酶标显色反应检测NASBA扩增产物，建立了检测 HPPRRSV的 NASBA－ELISA。该法可特异地检测HP－PRRSV，灵敏度达到101.83TCID50／mL，而对PRRSV美洲型经典毒株检测结果则为阴性。

2.6 胶体金免疫层析技术

胶体金免疫层析技术（gold immunochromatography assay，GICA）是一种新型检测技术。Zhou S H等［12］采用两种胶体金标记的 MAb D5（抗N蛋白）和E9（抗M蛋白），在硝酸纤维素膜的检测线和对照线上分别喷上兔抗胶体金标记MAb D5和E9、山羊抗鼠PRRS抗体，成功研制出PRRSV金免疫层析测试条，在反应中PRRSV首先结合带有胶体金的D5和E9的混合物，然后继续层析与兔抗D5、D9二抗结合，最终出现轻微的紫红色带，未结合的MAb将与山羊抗鼠抗体结合而在控制带处显色。Li X S等［13］利用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记抗PRRSV N蛋白的MAb 2D7制备免疫检测探针，将抗PRRSV N蛋白的MAb 1G7和山羊抗鼠IgG抗体印迹在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和质控线，组装成胶体金免疫层析试纸条，建立了能同时检测PRRSV美洲型经典毒株及变异毒株的GICA。GICA使用简便，成本低，不需特殊仪器设备，非常适合基层和现场使用。

3 病毒核酸的检测方法

3.1 反转录－聚合酶链反应

1987年之后发展起来的聚合酶链反应技术（polymerase chain reaction，PCR）为病毒性疾病的诊断提供了一种崭新的手段，在PRRSV核酸检测中得到广泛应用。2006年高致病性PRRS在我国发生和流行后，周丹等［14］针对Nsp2基因序列设计特异性引物，建立了鉴别诊断PRRSV经典株与变异株的一步法RT－PCR检测方法。为应对国内美洲型经典毒株、变异毒株以及欧洲型毒株同时存在的复杂状况，施开创等［15］分别针对PRRSV Nsp2、ORF5、ORF7基因序列设计3对特异性引物，建立了能够同时检测并区分美洲型经典毒株、变异毒株以及欧洲型毒株的多重RT－PCR检测方法。为了区分 HP－PRRSV与基因缺失弱毒疫苗株，梅林等［16］建立了可鉴别HP－PRRSV野毒株与基因缺失弱毒TJM－F92疫苗株的一步法RT－PCR，为鉴别接种TJM－F92疫苗猪群中的PRRSV野毒感染猪与疫苗免疫猪提供了方法。

3.2 实时荧光定量反转录－聚合酶链反应

实时 荧 光 定 量 PCR／RT－PCR 技 术 （real－time fluorescent quantitative PCR／RT－PCR，FQ－PCR／RT－PCR）于1996年由美国ABI公司推出，是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。在检测PRRSV核酸时常用基于SYBR GreenⅠ染料以 及 基 于 TaqMan 探 针 的 FQ－RT－PCR 方法［17－18］。在 FQ－RT－PCR 基 础 上，Kleiboeker S B等［19］针对PRRSV ORF7基因及3＇UTR保守区域设计引物及探针，建立了检测PRRSV欧洲型和美洲型毒株的二重TaqMan FQ－RT－PCR方法。Chen N H等［20］基于 MGB探针，建立了鉴别PRRSV美洲型经典毒株与变异毒株的二重FQ－RT－PCR方法。最近，Wernike K等［21］利用3对引物和3条TaqMan探针首次建立了能同时检测PRRSV美洲型经典株、变异株及欧洲型毒株的多重TaqMan FQ－RT－PCR方法。多重 FQ－RT－PCR方法的建立和应用，为快速鉴别检测日益复杂的PRRSV流行毒株提供了有效的技术手段。

3.3 原位杂交技术

原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）在PRRSV检测中也得到了应用。李雪梅等［22］根据PRRSV ORF6和ORF7保守序列设计寡核苷酸探针，应用生物素标记，建立了检测PRRSV核酸的ISH，并应用于感染仔猪组织石蜡切片的检测。Mostegl M M等［23］建立的ISH，利用甲醛固定、并经蛋白酶K处理的组织切片，固定23周后仍能检测到PRRSV核酸。

3.4 基因芯片技术

基因芯片技术（gene chip technology）是近年发展起来的一种新型实用的生物技术。郭焕成等［24］根据PRRSV美洲型经典毒株和变异毒株设计扩增美洲型毒株保守序列和Nsp2基因缺失区域的二重PCR引物，并设计美洲型毒株通用寡核苷酸探针和非缺失株相对于变异株Nsp2基因缺失区域的探针，成功建立PRRSV经典毒株与变异毒株的基因芯片鉴别方法。叶芬等［25］根据PRRSV、猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的基因组序列，设计特异性引物和寡核苷酸探针，并将探针按所设计阵列固定于表面经氨基化修饰的玻片上，制备出寡核苷酸芯片；通过引物标记及特异性验证，建立了带标记引物的多重PCR检测体系，从而产生大量可与寡核苷酸探针特异性互补的带标记的DNA片段；将标有荧光染料的扩增产物与芯片上寡核苷酸探针杂交，扫描、分析芯片上荧光信号，其检测结果与PCR／RT－PCR的符合率高达92%。

3.5 反转录－环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术（loop－mediated isothermal amplification，LAMP）首次出现于2000年，近年开始有应用于PRRSV检测的报道。Rovira A等［26］分别针对PRRSV美洲型和欧洲型毒株ORF7基因设计2套引物，成功建立了检测PRRSV的二重反转录 LAMP（reverse transcription LAMP，RT－LAMP）。李吉达等［27］针对 PRRSV ORF7基因设计特异性引物，成功建立了能同时检测PRRSV美洲型经典株和变异株的RT－LAMP，其敏感性比RT－PCR高100倍，检测结果与病毒分离的符合率为100%。而Gao M 等［28］则针对PRRSV最保守的ORF6基因设计一套引物，成功建立了能同时检测PRRSV美洲型经典株和变异株的RTLAMP，其敏感性比RT－PCR高100倍，与FQ－RTPCR相当。RT－LAMP操作简单，不需复杂的仪器，非常适合基层和现场检测。

4 其他检测技术

4.1 聚合酶链反应与变性高效液相色谱技术

2012年，杨春华等［29］根据PRRSV ORF5基因设计特异性引物，利用RT－PCR扩增产物结合变性高效液相色谱（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）技术分析，建立了PRRSV的PCR－DHPLC检测技术，其灵敏度可达1.0×101拷贝／μL，对16份疑似病料的检测结果与SYBR Green I FQ－RT－PCR 的符合率为100%。该法可用于临床PRRSV感染的早期诊断以及分子流行病学调查。

4.2 米氏散射免疫凝集试验

近年来，Song J Y等［30］利用米氏散射免疫凝集试验（Mie scattering immunoagglutination assay）制备微流体免疫传感器，用于检测PRRSV美洲型毒株。该方法是在Y形的微通道中，抗PRRSV抗体被结合到高度羧酸化的聚苯乙烯微颗粒表面，并与稀释的PRRSV组织样本混合。抗原抗体结合引发微粒免疫凝集反应，这种反应通过微钳体光纤380nm入射光束的45°角前倾光散射来检测。该法灵敏度达到10－3TCID50／mL，高于普通 RT－PCR的10TCID50／mL 及 FQ－RT－PCR 的 1TCID50／mL，且耗时短，每个试验不到5min。在微流体芯片上进行免疫凝集试验有望发展成为一种实时检测动物病原体的重要方法。

5 展望

综上所述，PRRSV主要检测技术的研究取得了长足进展，原有的检测技术得到了改进和提高，同时新的检测技术不断涌现和被应用。随着PRRSV及相关生物技术研究的不断深入，随着新理论新技术的不断出现以及更多新仪器新设备的创造发明，现有的检测技术将得到不断改进，同时全新的检测技术将会不断涌现。敏感、特异、快速、简便、高通量的检测技术将是发展的优先方向。

［1］ Provost C，Jia J J，Music N，et al.Identification of a new cell line permissive to porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection and replication which is phenotypically distinct from MARC－145cell line［J］.Virol J，2012，9：267.

［2］ Tong G Z，Zhou Y J，Hao X F，et al.Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome，China［J］.Emerg Infect Dis，2007，13（9）：1 434－1 436.

［3］ Kim H，Kim H K，Jung J H，et al.The assessment of efficacy of porcine reproductive respiratory syndrome virus inactivated vaccine based on the viral quantity and inactivation methods［J］.Virol J，2011，8：323.

［4］ Karniychuk U U，Geldhof M，Vanhee M，et al.Pathogenesis and antigenic characterization of a new East European subtype 3porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolate［J］.BMC Vet Res，2010，6：30.

［5］ Benfield D A，Nelson E，Collins J E，et al.Characterization of swine infertility and respiratory syndrome（SIRS）virus（isolate ATCC VR－2332）［J］.J Vet Diagn Invest，1992，4（2）：127－133.

［6］ 陈仕龙，黄海清，林天龙，等.高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒间接免疫荧光鉴别方法的建立［J］.中国兽医科学，2009，39（1）：41－44.

［7］ 袁 婧，刘长明，魏 萍，等.高致病性猪蓝耳病直接免疫荧光诊断方法的建立及其应用［J］.中国兽医学报，2009，31（6）：448－453.

［8］ Han K，Seo H W，Oh Y，et al.Evaluation of monoclonal antibody－based immunohistochemistry for the detection of European and North American porcine reproductive and respiratory syndrome virus and a comparison with in situ hybridization and reverse transcription polymerase chain reaction［J］.J Vet Diagn Invest，2012，24（4）：719－724.

［9］ 杨 鸿，钱君娣，邓 桦，等.Envision免疫组化技术在诊断猪繁殖与呼吸综合征中的应用［J］.中国兽医学报，2010，30（2）：159－161.

［10］ 翁善钢.双抗体夹心ELISA检测猪繁殖与呼吸综合征病毒方法的建立［J］.饲料与畜牧：规模养猪，2010（10）：33－35.

［11］ 梁海霞，薛青红，高金源，等.致病性猪生殖与呼吸综合征病毒NASBA－ELISA检测方法的建立［J］.中国兽医科学，2009，39（5）：401－404.

［12］ Zhou S H，Cui S J，Chen C M，et al.Development and valida－tion of an immunogold chromatographic test for on－farm detection of PRRSV［J］.J Virol Meth，2009，160（1－2）：178－184.

［13］ Li X S，Fu F，Lang Y K，et al.Development and preliminary application of an immunochromatographic strip for rapid detection of infection with porcine reproductive and respiratory syndrome virus in swine［J］.J Virol Meth，2011，176（1－2）：46－52.

［14］ 周 丹，郭万柱，漆信桥，等.PRRSV普通株与变异株鉴别诊断RT－PCR方法的建立与临床应用［J］.中国兽医学报，2012，32（3）：367－370.

［15］ 施开创，莫胜兰，张步娴，等.同时检测美洲型及欧洲型PRRSV的多重RT－PCR检测方法的建立及应用［J］.中国预防兽医学报，2012，34（10）：810－814.

［16］ 梅 林，高英杰，梁智选，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒野毒株与基因缺失弱毒疫苗株TJM－F92一步RT－PCR鉴别方法的建立［J］.中国生物制品学杂志，2012，25（4）：492－494.

［17］ 祝秀梅，马全英，杜 平，等.基于TaqMan探针的猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒实时荧光定量PCR方法的建立［J］.中国人兽共患病学报，2012，28（6）：579－582.

［18］ Chai Z，Ma W，Fu F，et al.A SYBR Green－based real－time RT－PCR assay for simple and rapid detection and differentiation of highly pathogenic and classical type 2porcine reproductive and respiratory syndrome virus circulating in China［J］.Arch Virol，2013，158（2）：407－415.

［19］ Kleiboeker S B，Schommer S K，Lee S M，et al.Simultaneous detection of North American and European porcine reproductive and respiratory syndrome virus using real－time quantitative reverse transcriptase－PCR［J］.J Vet Diagn Invest，2005，17（2）：165－170.

［20］ Chen N H，Chen X Z，Hu D M，et al.Rapid differential detection of classical and highly pathogenic North American porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China by duplex real－time RT－PCR［J］.J Virol Meth，2009，161（2）：192－198.

［21］ Wernike K，Hoffmann B，Dauber M，et al.Detection and typing of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus by multiplex real－time RT－PCR［J］.PLoS One，2012，7（6）：e38251.

［22］ 李雪梅，程安春，汪铭书，等.寡核苷酸探针原位检测石蜡切片中PRRSV核酸［J］.中国兽医学报，2006，26（4）：350－353.

［23］ Mostegl M M，Richter B，Dinhopl N，et al.Influence of prolonged formalin fixation of tissue samples on the sensitivity of chromogenic in situ hybridization［J］.J Vet Diagn Invest，2011，23（6）：1212－1216.

［24］ 郭焕成，席 进，李江南，等.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2缺失变异株与经典美洲型毒株基因芯片鉴别方法的建立［J］.中国生物制品学杂志，2010，23（11）：1254－1259.

［25］ 叶 芬，蔡家利，王 昱，等.猪瘟、猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征寡核苷酸芯片诊断方法的建立与初步应用［J］.中国兽医学报，2011，31（10）：1395－1399.

［26］ Rovira A，Abrahante J，Murtaugh M，et al.Reverse transcription loop－mediated isothermal amplification for the detection of reproductive and respiratory syndrome［J］.J Vet Diagn Invest，2009，21（3）：350－354.

［27］ 李吉达，尹燕博，于明科，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒RTLAMP检测方法的建立［J］.畜牧与兽医，2011，43（9）：62－65.

［28］ Gao M，Cui J，Ren Y，et al.Development and evaluation of a novel reverse transcription loop－mediated isothermal amplification（RT－LAMP）assay for detection of type II porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.J Virol Meth，2012，185（1）：18－23.

［29］ 杨春华，祝建新，钟 毅，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒PCRDHPLC检测新技术的建立及应用［J］.中国兽医学报，2012，32（2）：167－171.

［30］ Song J Y，Lee C H，Choi E J，et al.Sensitive Mie scattering immunoagglutination assay of porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）from lung tissue samples in a microfluidic chip［J］.J Virol Meth，2011，178（1－2）：31－38.