菌种滤纸保存法的应用

文德学，顾雪梅，王兴林，胡忠惠，兰兴翠，李 莹（.贵州省黔西南州人民医院，贵州兴义 56400；.贵州省兴义市人民医院，贵州兴义 56400）

实验室质控工作需要保存各种质控菌株，保证质控菌株的稳定是做好质控工作的前提条件。保存菌种方法很多，根据不同的微生物菌株或不同的实验要求，可选用不同的保存方[1]。常见的有传代培养保存法、液体石蜡覆盖保存法、冷冻保存法、冷冻干燥保存法等[2－3]。铜绿假单胞菌、大肠埃希菌等许多非苛养菌质控菌株都是生长条件要求不高的细菌，通常用斜面琼脂培养基和半固体琼脂培养基覆盖石蜡油等方法均可很好保存，但是需要频繁移种以保证存活率，而反复传代又易导致细菌变异并造成菌种污染。一些常用的苛养质控菌株如肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌等在斜面琼脂培养基和半固体琼脂培养基上不能存活，没有条件的基层实验室难以保存这些苛养菌。在保存过程中必须使微生物的代谢处于相对静止状态，才能在一定时间内使其不发生变异又保持很好的活性。作者借鉴应用菌种滤纸保存法，基本满足上述3个条件，实验证明是一种经济有效、简便的菌种保存方法，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 自封袋：根据需要购买适宜大小的自封袋，也可使用试剂附送的自封袋。无菌EP管：将市售2cm直径EP管置于密闭的消毒盒内，经121℃高压蒸汽灭菌25min备用。无菌滤纸条：将市售滤纸用剪刀剪成约0.5cm×1.0cm滤纸条置于带塞的小试管内，经121℃高压蒸汽灭菌25min备用。菌种：铜绿假单胞菌（ATCC 27853）、大肠埃希菌（ATCC 25922）、金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）3株标准菌株购于卫生部临床检验中心，福氏志贺菌、枯草芽孢杆菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、豚鼠气单胞菌、粪肠球菌、弗劳地枸櫞酸杆菌、伤寒沙门菌、痢疾志贺菌、宋内志贺菌、鲍曼不动杆菌、黏质沙雷菌、嗜麦芽窄食单胞菌、甲型副伤寒杆菌、摩根菌、白色假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、季也蒙念珠菌、肺炎链球菌、淋球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、无乳链球菌、屎肠球菌、卡他莫拉菌、产单核李斯特菌、星座链球菌等31株菌株来自于临床标本分离的菌株，经传代分纯培养而得。

1.2 仪器与试剂 血平皿及巧克力平皿：成品购于安图公司，在适宜的贮存条件下、有效期内使用；沙保罗斜面培养基：半成品购于杭州天合微生物试剂有限公司，按照说明书配制经121℃高压蒸汽灭菌25min后摆成斜面备用；触酶试剂：市售3%过氧化氢溶液，有效期内使用，试验时金黄色葡萄球菌同步作阳性对照；胆汁溶菌实验试剂：取新鲜牛胆汁，无菌分装（2毫升/管）密封置－20℃冰箱，可保存1年以上，试验时用肺炎链球菌平行做阳性对照；营养肉汤培养基：半成品购于杭州天合微生物试剂有限公司。按照说明书配制成成品肉汤后，分装于有塞小试管，每管1mL，经121℃25min高压蒸汽灭菌后备用；－20℃冰箱：购于海尔公司的－20℃低温冰箱；细菌鉴定及药敏试验仪器：购于美国BD公司的Phoein100全自动细菌鉴定仪。

1.3 方法

1.3.1 菌种保存 将目标菌种在血平皿或巧克力平皿上划线分离培养18～24h，获取纯净菌落，然后用无菌眼科镊夹取1张无菌0.5cm×1.0cm滤纸条，根据菌落大小，蘸取一到数个菌落（以粘菌面积不超过滤纸1/3，滤纸条尚未完全被水分浸湿为宜），放入无菌EP管中，盖紧EP管盖。根据需要，一次可制备数十条，1～2条装1个EP管，贴上标签，标签上注明菌种名称，保存数量和保存日期，再置于自封袋内，排尽袋内空气，封严袋口，放入－20℃冰箱保存。

1.3.2 菌种的生物性状观察和检测 将上述方法保存的菌种于1个月、3个月、6个月、1年、2年对应时间取出上述各种菌株的一只菌种管直接置于室温环境平衡5～10min，无菌操作取出相应菌种滤纸条，放入无菌营养肉汤管中复溶，转种在血平皿或巧克力平皿上35℃培养18～24h，观察所保存的31株菌株的存活情况、菌落形态特征等有无变化；并对其中2株标准菌株：铜绿假单胞菌（ATCC 27853）和大肠埃希菌（ATCC 25922）在保存1年和2年时复溶转种血平皿35℃培养18～24 h后，用Phoein100全自动细菌鉴定仪2次进行生化鉴定和药敏试验进行比较。

2 结 果

2.1 2009年5月保存17株菌株，分别是福氏志贺菌、枯草芽孢杆菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、豚鼠气单胞菌、粪肠球菌、弗劳地枸櫞酸杆菌、伤寒沙门菌、甲型副伤寒杆菌、卡他莫拉菌、摩根菌、产单核李斯特菌、无乳链球菌、屎肠球菌、星座链球菌；2009年7月保存5株菌株，分别是痢疾志贺菌、宋内志贺菌、鲍曼不动杆菌、黏质沙雷菌、嗜麦芽窄食单胞菌；2009年10月保存5株酵母样真菌，分别是白色假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、热带念珠菌、季也蒙念珠菌、光滑念珠菌。一共22株非苛养菌及5株酵母样真菌，在保存到上述1个月、3个月、6个月、1年、2年5个时间段时用营养肉汤复苏分别移种到血平皿和沙保罗琼脂斜面培养基上，经35℃培养18～24h，22株菌存活率均为100%，菌落形态特征无明显改变且生长良好。

2.2 2009年7月保存2株菌株，分别是肺炎链球菌和淋球菌。肺炎链球菌在上述1个月、3个月、6个月、1年、2年5个时间段用营养肉汤复苏移种血平皿经35℃、5%二氧化碳（CO2）环境培养18～24h均100%存活，菌落形态特征无明显改，触酶试验、胆汁溶菌试验均为阳性。在保存2年时生长稍欠佳，仅生长量减少，其他特征无明显改变。淋球菌在保存1个月后经2次用营养肉汤复苏移种于血平皿及巧克力平皿经35℃、5%CO2环境培养18～24h均不生长，证明已死亡。

2.3 2011年3月保存2株菌株，分别是脑膜炎奈瑟菌和流感嗜血杆菌。到2011年9月经1、3、6个月3个时间段用营养肉汤复苏移种巧克力平皿上经35℃、5%CO2环境培养18～24h均100%存活，菌落形态特征无明显改变且生长良好。

2.4 2009年3月保存3株标准菌株，分别是铜绿假单胞菌（ATCC 27853）、大肠埃希菌（ATCC 25922）、肺炎克雷伯菌肺炎亚种（GY2000），经1个月、3个月、6个月、1年、2年5个时间段用营养肉汤复苏移种血平皿上经35℃培养18～24h存活率均为100%，细菌的生长特性、形态染色特征无明显变化，其中铜绿假单胞菌（ATCC 27853）、大肠埃希菌（ATCC 25922）2株标准菌株在保存到1年（2010年10月31日）和2年（2011年11月25日）时用Phoein100全自动细菌鉴定仪，45项生化反应2次检测结果完全相同，说明2株标准菌株在保存2年后，其生化反应特性没有发生改变。药敏试验2次试验结果也完全相同，结果见表1。

3 讨 论

用滤纸法保存的22株非苛养菌及5株酵母样真菌在保存2年后其存活率均为100%，菌落形态特征无明显改变且生长良好。苛养菌中肺炎链球菌在保存2年时均100%存活，血平皿上菌落形态特征无明显改变，触酶试验、胆汁溶菌试验均为阳性，在2年时生长稍欠佳，仅生长量减少，可能有部分菌种死亡，其他特征无明显改变；脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌保存半年均100%存活，在巧克力平皿上菌落形态特征无明显改且生长良好；淋球菌在保存1个月后就已经死亡。对于苛养菌株，除对温度比较敏感的淋球菌不能用该方法保存外，肺炎链球菌存活时间长，存活率较高，也比较适合用该方法保存；脑膜炎奈瑟菌和流感嗜血杆菌，在短时间内存活较好，但长时间保存和对生物学特性的影响尚待进一步研究。

标准菌株铜绿假单胞菌（ATCC 27853）、大肠埃希菌（ATCC 25922）、肺炎克雷伯菌肺炎亚种（GY2000）用滤纸法保存近3年，存活率均为100%，菌落形态特征无明显变化。铜绿假单孢菌（ATCC 27853）、大肠埃希菌（ATCC 25922）2株标准菌株经Phoein100全自动细菌鉴定仪检测，2年内生物学特性差异无统计学意义（P＞0.05），药物敏感性试验少部分检测值与参照值不完全相符，但2次检测值相同，说明该方法保存2株标准菌株2年内是稳定的，与参照值不符可能是实验前的菌株变异造成的。实验结果表明，滤纸保存法能满足实验室室内质控非苛养菌标准菌株的保存要求，同时也适合基础实验室保存一些用于教学的普通非苛养菌株。此方法无需特殊设备，操作简单，经济实用。保存时间较长，有报道此法可保存铜绿假单胞菌5年甚至更长时间，并且菌种生物学特性稳定，是一种适合于基层实验室推广应用的菌种保存方法。

[1] 刘英，王磊，吴红艳，等.铜绿假单胞菌菌种滤纸保存法探讨[J].中国病原生物学杂志，2009，4（9）：716－719.

[2] 叶晴，尹光琳.用真空冷冻干燥法保存微生物菌株[J].现代科学仪器，2000，12（4）：19－20.

[3] 叶应妩，王毓三.全国临床检验操作规程[M].2版.南京：东南大学出版社，1997：632.